任淵 陳農(nóng) 岳春林

1甘肅政法學(xué)院體育教學(xué)部（甘肅 蘭州 730070） 2蘇州大學(xué)體育學(xué)院

工作記憶（working memory，WM）的概念是Baddeley和Hitch在分析記憶信息三級(jí)加工模型中的短時(shí)記憶的基礎(chǔ)上提出的，工作記憶由中央執(zhí)行系統(tǒng)等組成，而中央執(zhí)行系統(tǒng)位于前額葉［1，2］。 工作記憶為復(fù)雜的任務(wù)，如圍棋比賽中的學(xué)習(xí)、計(jì)算、推理和問(wèn)題解決等提供臨時(shí)的儲(chǔ)存空間和加工時(shí)所必需的信息［3-5］。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，延遲測(cè)試（delayed alternation tasks）和視覺(jué)分辨試驗(yàn)與前額葉皮層的多巴胺（Dopamine，DA）功能相關(guān)，兒茶酚胺氧位甲基化轉(zhuǎn)移酶（Catechol-O-Methyltransferase，COMT）的遺傳變異可影響多巴胺在前額葉的釋放量［6］。圍棋比賽常要求運(yùn)動(dòng)員在大強(qiáng)度腦力負(fù)荷的條件下，無(wú)間歇或只有很少間歇地連續(xù)工作六、七個(gè)小時(shí)。連續(xù)高強(qiáng)度作業(yè)中大腦工作能力的相關(guān)研究，不僅有實(shí)際應(yīng)用意義，而且有助于探討腦疲勞的發(fā)生機(jī)理。本研究探討不同COMT基因型的圍棋選手在連續(xù)3-back（倒數(shù)第三位數(shù)字回憶）任務(wù)中，視覺(jué)事件相關(guān)電位（Event-related potentials，ERP）與 COMT 基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)。

1 對(duì)象與方法

1.1 被試者

被試者為121名蘇州棋院注冊(cè)的有業(yè)余段位的少年選手，（9.4±2.6）歲，右利手，健康狀況良好，有償參加本實(shí)驗(yàn)，并簽署知情同意書。

1.2 基因型測(cè)定

采用RFLP-PCR方法測(cè)試COMT的Val158Met多態(tài)性。PCR引物為5′-TCG TGG ACG CCG TGA TTC AGG-3′和 5′-AGG TCT GAC AAC GGG TCA GGC-3′。PCR 擴(kuò)增體系為 30 μl，PCR 條件包括 94℃預(yù)變性 5 min，接下來(lái)是30個(gè)循環(huán)的94℃變性30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 1 min， 最后 72℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物在 55℃使用限制性內(nèi)切酶 NlaⅢ（New England Biolabs，Cat，#R0125V）消化 3 h。 消化產(chǎn)物經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分型（丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺的比例為 29.2∶0.8），經(jīng)簡(jiǎn)化銀染［7］，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果。高活性Val-158顯示81 bp和116 bp兩個(gè)條帶；低活性Met-158顯示81 bp和98 bp兩個(gè)條帶。電泳出現(xiàn)136 bp條帶為限制性內(nèi)切酶不完全消化產(chǎn)物［8］?；蛐蜏y(cè)定在蘇州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

進(jìn)行COMT基因分型后，選擇不同基因型被試者24人 （Val/Val型 10人，Val/Met型 8人，Met/Met型6人）進(jìn)行視覺(jué)ERP測(cè)試，所有被試者視力或校正視力正常。

1.3 視覺(jué)ERP測(cè)試

采用3-back范式，即被試者判斷當(dāng)前呈現(xiàn)的數(shù)字和此數(shù)字之前呈現(xiàn)的第3位數(shù)字是否匹配?；€為刺激呈現(xiàn)前250 ms，分析時(shí)程（epoch）為刺激呈現(xiàn)后 2200 ms，并采用 16 Hz（24 dB/octave）進(jìn)行數(shù)字低通濾波，不正確反應(yīng)的數(shù)據(jù)被自動(dòng)刪除。波幅超出范圍（－100μV，＋100μV）的波形視為偽跡自動(dòng)去除，對(duì)反應(yīng)正確的數(shù)據(jù)進(jìn)行疊加（averge）。根據(jù)總平均圖確定ERP的P300的時(shí)間分析窗口。視覺(jué)事件相關(guān)電位P300波幅取300～600 ms時(shí)間窗口內(nèi)波峰值。

評(píng)定實(shí)驗(yàn)的儀器為美國(guó)NeuroScan公司生產(chǎn)的腦電記錄系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)測(cè)試在蘇州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，數(shù)據(jù)分析在甘肅政法學(xué)院體育教育部計(jì)算機(jī)房進(jìn)行。腦電（EEG）信號(hào)以Cz位為基準(zhǔn)，以左乳突單極作為參考電極，按國(guó)際10-20系統(tǒng)擴(kuò)展的40導(dǎo)電極帽記錄EEG。進(jìn)行持續(xù)1小時(shí)的3-back任務(wù)，每5 min為一個(gè)Block，共12個(gè)Block，經(jīng)過(guò)疊加得到視覺(jué)事件相關(guān)電位的平均P300。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

不同基因型分析采用卡方檢驗(yàn)。不同基因型被試腦電、持續(xù)3-back工作記憶任務(wù)成績(jī)的連續(xù)變量經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析的雙向分類的方差分析，并進(jìn)一步進(jìn)行Bonferroni組間多重比較。

對(duì)于不同Block之間的連續(xù)變量，采用兩因素重復(fù)測(cè)量方差方法，分析以中線分布的Fz、Cz、Pz三個(gè)電極的ERP數(shù)據(jù)進(jìn)行［9］，二因素分別為Block、電極位置 （Fz，Cz，Pz）， 方差分析的 P值采用 Greenhouse Geisser法校正。

對(duì)3-back任務(wù)相關(guān)的腦電參數(shù)與正確率分別采用頻數(shù)分布分析，結(jié)合偏度系數(shù)及其標(biāo)準(zhǔn)誤、峰度系數(shù)及其標(biāo)準(zhǔn)誤的結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 COMT等位基因及基因型頻率的描述

121名被試者的COMT基因型的分布見(jiàn)表1。Val/Val型 70人，Val/Met型 45人，Met/Met型 6人。經(jīng)檢測(cè)，COMT等位基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡（χ2=0.35，P>0.05）。

表1 被試者COMT第158位密碼子基因型和等位基因型的分布（n=121）

2.2 持續(xù)3-back工作記憶任務(wù)成績(jī)

將12個(gè)Block的3-back任務(wù)的正確率作為行為學(xué)指標(biāo)，得到各基因組的平均成績(jī)：Val/Val型為（90.1±10.1）%；Val/Met型為 （84.5±9.4）%；Met/Met型為（88.2±8.8）%。兩兩比較后，Val/Val型的 3-back成績(jī)與Val/Met型之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.01），而Met/Met型成績(jī)處于中間，與Val/Val型和Val/Met型的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.3 3-back任務(wù)中不同基因型組被試者P300波幅的比較

經(jīng)單因素方差分析，在 Fz（P=0.006）、Cz（P=0.000）、Pz（P=0.000）三個(gè)電極上，Val158Met不同基因型P300波幅的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步Bonferroni檢驗(yàn)表明，三個(gè)電極（Fz、Cz、Pz）中，Val/Val型和Val/Met型之間P300波幅的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.01），Val/Val型被試者在三個(gè)電極中誘發(fā)的P300波幅均明顯高于Val/Met型。Met/Met型被試者P300波幅值居中（見(jiàn)表2）。

表2 3-back任務(wù)中不同基因型被試者P300波幅的比較

3 討論

有研究報(bào)道了COMT基因多態(tài)性的人種差異［10］。本研究中，被試者M(jìn)et/Met基因型頻率為5%，明顯低于以往報(bào)道的英國(guó)人和美國(guó)人的頻率 （32%，25%）［10］，但與亞洲的日本人頻率相近 （6%）［8］。 本實(shí)驗(yàn)被試者的COMT基因型頻率與英國(guó)人（χ2=34.2，P<0.005）和美國(guó)人（χ2=48.6，P<0.005）的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，等位基因頻率與同為亞洲人種的日本人之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.8，P>0.05）。這與吳懷安等對(duì)普通人COMT基因多態(tài)性的分型吻合［11］。

COMT的活性差異是由于該基因的第4個(gè)外顯子第158位氨基酸上存在一個(gè)G/A突變，使其編碼的氨基酸由纈氨酸（Val）變成蛋氨酸（Met），酶活性下降至四分之一，且這一突變具有共顯性［12］。Met158等位基因產(chǎn)生相對(duì)低的COMT活性，導(dǎo)致前額葉（prefrontal cortex，PFC）多巴胺的升高，允許多巴胺從突觸間隙彌散得更遠(yuǎn)，激活了突觸外D1受體，有利于工作記憶認(rèn)知的穩(wěn)定性［13］。相反，Val158等位基因編碼的COMT具有相對(duì)高的活性，導(dǎo)致PFC多巴胺下降，限制了多巴胺從突觸間隙彌散，有利于激活突觸內(nèi)的D2受體。Val158等位基因?qū)е铝饲邦~葉神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的低穩(wěn)定性，這會(huì)引起記憶信息保持能力降低［14，15］，但同時(shí)提高了記憶刷新能力即認(rèn)知靈活性［16］。不同的COMT基因型可導(dǎo)致前額葉皮層中不同的多巴胺水平，而皮層中的多巴胺水平?jīng)Q定了D1、D2受體激活的相對(duì)平衡。有研究表明，工作記憶能力和 D1/D2 比率成倒“U”型曲線關(guān)系［17，18］。 D1/D2結(jié)合比率被破壞，認(rèn)知成績(jī)可能受到兩個(gè)原因中的一個(gè)的影響而下降：一是PFC中D1調(diào)控信號(hào)的缺乏（低多巴胺能狀態(tài)），它影響神經(jīng)沖動(dòng)易于衰減或?qū)斎胄盘?hào)的競(jìng)爭(zhēng)抑制，導(dǎo)致較差的靶信號(hào)辨別力。另一原因是過(guò)多巴胺能狀態(tài)，它關(guān)聯(lián)著過(guò)度的D1調(diào)控，可以允許PFC穩(wěn)定保持信息，但更新效率不高，表現(xiàn)為保守、刻板的行為，缺乏任務(wù)需要的認(rèn)知靈活性［19］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，工作記憶能力中的認(rèn)知穩(wěn)定性和認(rèn)知靈活性應(yīng)作為兩個(gè)指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)工作記憶成績(jī)。在本實(shí)驗(yàn)的3-back任務(wù)中，認(rèn)知靈活性最好的Val/Val組和認(rèn)知穩(wěn)定性最好的Met/Met均獲得了較好的工作記憶任務(wù)成績(jī)，而認(rèn)知靈活性和認(rèn)知穩(wěn)定性均是中等的Val/Met組，3-back任務(wù)成績(jī)最差。

P300是多神經(jīng)源、多成分的，低概率、不作反應(yīng)的新奇性刺激均可產(chǎn)生P3a（主要在Fz區(qū)），隨后的記憶比較加工則伴隨著P3b的生成（Pz區(qū)最顯著）［20］。PFC的參與是P3a生成與注意控制所必需的。改變對(duì)刺激物的注意和對(duì)記憶加工的需要會(huì)影響P300波幅。此外，隨后的注意資源的參與對(duì)P300波幅有影響，當(dāng)記憶負(fù)荷增加，減少了P300的波幅，歸因于任務(wù)加工需求的上升［21］。本實(shí)驗(yàn)中，Val/Val純合子關(guān)聯(lián)著Fz區(qū)較高的P300幅度，說(shuō)明Val/Val純合子對(duì)任務(wù)投入了更多的注意資源，這可能和Val/Val純合子被試較好的工作記憶的更新能力相關(guān)。Val/Met組被試者在進(jìn)行3-back任務(wù)時(shí)的復(fù)述、存儲(chǔ)、更新等子任務(wù)可能需要分配更多的資源，導(dǎo)致Val/Met組被試者在完成同一任務(wù)時(shí)負(fù)荷較高，造成Pz區(qū)的P300波幅低于Val/Val、Met/Met基因型被試者。此外，較復(fù)雜的任務(wù)需要分配更多注意給子任務(wù)。而每一個(gè)子任務(wù)有自己的潛伏期，會(huì)對(duì)P300成分起作用。這種潛伏期的不匹配，會(huì)干擾頂葉影響P300形成的不同P300發(fā)生源，減少了每個(gè)刺激的疊加波幅［22］。 本研究和國(guó)外報(bào)道不一致［10］，原因可能包括人種之間的差異以及評(píng)定工作記憶的任務(wù)不同。

4 小結(jié)

COMT基因多態(tài)性存在人種差異，不同COMT基因多態(tài)型的少年圍棋選手在工作記憶任務(wù)中表現(xiàn)不同。

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