龔安華 吳濤 吳靜 錢琛

摘要：以２，３－環(huán)氧丙基三甲基氯化銨（ＧＴＡ）和殼聚糖為原料制備水溶性的殼聚糖季銨鹽２－羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖（ＨＴＣＣ），采用傅立葉紅外光譜儀（ＦＴＩＲ譜圖）和核磁共振儀（１Ｈ－ＮＭＲ圖譜）表征ＨＴＣＣ的結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行抗菌性研究。結(jié)果表明，ＨＴＣＣ溶液和浸泡過ＨＴＣＣ的無紡布對大腸桿菌（Escherichia coli）和空腸彎曲菌（Cａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）有抑菌效果，其中對空腸彎曲菌的最低抑菌濃度（ＭＩＣ）為８ ｍｇ／ｍＬ，說明ＨＴＣＣ是一種具有應(yīng)用潛力的高分子抗菌劑。

關(guān)鍵詞：殼聚糖季銨鹽；表征；抗菌性；HTCC

中圖分類號：Ｏ６３６．１文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）06－1136-03

Characterization and Antimicrobial Activity of 2-Hydroxypropyltrimethyl Ammonium Chloride Chitosan

ＧONG Ａｎ－ｈｕａ，ＷU Ｔａｏ，ＷU Ｊｉｎｇ，ＱIAN Ｃｈｅｎ

(Department of Chemical Engineering, Yangzhou Polytechnic Institute, Yangzhou 225127, Jiangsu, China)

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｗａｔｅｒ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ ｏｆ 2-hydroxypropyltrimethyl ammonium chloride ｃｈｉｔｏｓａｎ（ＨＴＣＣ） ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｗｉｔｈ ２， ３－ｅｐｏｘｙｐｒｏｐｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（GTA）． Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＨＴＣＣ ｗａｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ ＦＴＩＲ ａｎｄ １Ｈ ＮＭＲ， ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＨＴＣＣ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅd ｔｈａｔ ｔｈｅ ｎｏｎ－ｗｏｖｅｎ ｆａｂｒｉｃｓ ｗｈｉｃｈ ｈａd ｂｅｅｎ ｉｍｍｅｒｓｅｄ ｉｎ ＨＴＣＣ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅd ｇｏｏｄ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ． Ｔｈｅ ｍｉｎｉｍｕｍ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ） ｏｆ ＨＴＣＣ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｃ. ｊｅｊｕｎｉ ｗａｓ ８ ｍｇ／ｍＬ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＨＴＣＣ waｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ ｏｆ ｃｈｉｔｏｓａｎ； ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ； ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ； 2-hydroxypropyltrimethyl ammonium chloride chitosan（ＨＴＣＣ）

殼聚糖（ＣＴＳ）是甲殼素經(jīng)濃堿溶液處理后脫去乙?；漠a(chǎn)物，又名甲殼胺、脫乙酰甲殼素，化學(xué)名 （１，４）－２－氨基－２－脫氧－β－Ｄ－葡萄糖。殼聚糖以其獨(dú)特的生物相容性、生物降解性、抗菌性、無毒性、生物活性和其獨(dú)特的物理化學(xué)屬性引起人們的重視，在化工、紡織、印染、造紙和醫(yī)藥等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景［１］。但是由于殼聚糖分子內(nèi)、分子間存在強(qiáng)大的氫鍵作用，大分子間存在著緊密的晶態(tài)有序結(jié)構(gòu)，難以熔化，也難以溶解于水和多數(shù)有機(jī)溶劑，限制了其實(shí)際應(yīng)用。而經(jīng)過衍生化的殼聚糖克服了其溶解性差的缺點(diǎn)，能很好溶解，并增加了正電性。

雖然目前已有文獻(xiàn)報道了殼聚糖的?；?、羧基化、烷基化、酯化、形成席夫堿和交聯(lián)等改性研究［２－５］，但對這些衍生物的應(yīng)用研究的報道卻較少。２－羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖（ＨＴＣＣ）是一種合成工藝較為成熟的水溶性殼聚糖衍生物，本試驗(yàn)利用環(huán)氧開環(huán)法［２］銨鹽制備ＨＴＣＣ，并進(jìn)一步研究ＨＴＣＣ的抗菌性。

１ 材料與方法

１．１材料

１．１．１試驗(yàn)試劑殼聚糖（脫乙酰度９０％，連云港生物制劑有限責(zé)任公司）；冰醋酸、氫氧化鈉、異丙醇、硫酸鈉、無水乙醇（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；２，３－環(huán)氧丙基三甲基氯化銨（ＧＴＡ）（工業(yè)級，杭州銀湖化工有限公司）；大腸桿菌、空腸彎曲菌（革蘭氏陰性菌）；無紡布（市售）；其他培養(yǎng)液（自制）。

１．１．２儀器與設(shè)備Ｔｅｎｓｏｒ ２７型傅立葉紅外光譜儀（德國Ｂｒｕｋｅｒ公司）；ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ生物分光光度計（德國Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司）；ＡＣＦ３００核磁共振光譜儀（德國Ｂｒｕｋｅｒ公司）。

１．２方法

１．２．１ＨＴＣＣ的合成［２］稱?。?ｇ殼聚糖溶于１００ ｍＬ ２％的乙酸溶液，攪拌溶解后逐滴加入１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ 溶液至ｐＨ為９，有大量白色絮狀殼聚糖析出，再浸泡８ ｈ，然后抽濾得到白色沉淀物用去離子水洗至中性。將白色沉淀物及１５ ｍＬ異丙醇加入到三頸瓶中，攪拌并升溫至８０ ℃，定時（每隔２ ｈ）滴入定量的ＧＴＡ異丙醇溶液（０．５ ｍｇ／ｍＬ），每次滴定時間為０．５ ｈ。反應(yīng)結(jié)束后，加入１５０ ｍＬ的無水乙醇進(jìn)行沉淀，抽濾后用無水乙醇洗滌３次，６５ ℃真空干燥２４ ｈ。

１．２．２ＨＴＣＣ的抗菌試驗(yàn)菌懸浮液的制備：將活化后的細(xì)菌用接種環(huán)挑取2環(huán)菌苔于無菌ＰＢＳ緩沖溶液中，使用ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ生物分光光度計調(diào)節(jié)ＯＤ值為１，備用。

抗菌效率的測定：?。?ｍＬ ＯＤ值為１的菌懸浮液加入到５ ｍｇ／ｍＬ的１００ ｍＬ殼聚糖季銨鹽溶液中，同時?。?ｍＬ菌液加入到１００ ｍＬ的ＰＢＳ緩沖液中作為對照，分別在混合后１５、３０、６０ ｍｉｎ涂平板，３７ ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)２４ ｈ，觀察試驗(yàn)結(jié)果。用平板計數(shù)法計數(shù)并計算抑菌率。

抑菌率＝■×１００％。

最低抑菌濃度（ＭＩＣ）的測定：用ＰＢＳ緩沖溶液配制不同濃度的ＨＴＣＣ溶液（０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ ｍｇ／ｍＬ），高壓滅菌。?。保眰€平板，分別取上述不同濃度ＨＴＣＣ溶液３００ μＬ涂覆平板，再?。保埃?μＬ的ＯＤ值為１的菌懸浮液均勻涂抹平板，置３７ ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)４８ ｈ后，觀察菌落的生長情況，以完全無菌落的ＨＴＣＣ溶液最低濃度為ＨＴＣＣ的最小抑菌濃度（ＭＩＣ）。

ＨＴＣＣ溶液浸漬無紡布的抑菌性：配制１０ ｍｇ／ｍＬ的ＨＴＣＣ溶液２５０ ｍＬ，高壓滅菌備用。取邊長２ ｃｍ的正方形無紡布２塊，分別編號ａ、ｂ。其中ａ樣放置在蒸餾水中浸泡２４ ｈ作為對照，ｂ樣放置在相同體積ＨＴＣＣ溶液中浸泡相同時間。取出無紡布并分別貼于平板中央，３７ ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)２４ ｈ，觀察菌落的情況。

１．２．３紅外光譜測定分析紅外光譜測定樣品的結(jié)構(gòu)，使用德國Ｂｒｕｋｅｒ公司的Ｔｅｎｓｏｒ２７型傅立葉紅外光譜儀，ＫＢｒ壓片，掃描范圍４ ０００~４００ ｃｍ－１，分析ＦＴＩＲ譜圖。

１．２．４１Ｈ核磁分析采用ＡＣＦ３００核磁共振光譜儀（５００ ＭＨｚ），Ｄ２Ｏ為溶劑，四甲基硅烷為內(nèi)標(biāo)，繪制分析１Ｈ－ＮＭＲ譜圖。

２結(jié)果與分析

２．１ＨＴＣＣ的抑菌特性

２．１．１ＨＴＣＣ抑菌效率由ＨＴＣＣ作用時間對抑菌率的影響（圖１）可見，作用時間越長，ＨＴＣＣ溶液抑菌效果越好，與大腸桿菌和空腸彎曲菌作用１５ ｍｉｎ后，抑菌率分別達(dá)到９７．７３％和９８．４０％。ＨＴＣＣ對空腸彎曲菌的抑菌率明顯高于對大腸桿菌的抑菌率，推測原因?yàn)榭漳c彎曲菌表面負(fù)電性高于大腸桿菌，增強(qiáng)了ＨＴＣＣ對空腸彎曲菌的吸附力。

２．１．２ＨＴＣＣ對空腸彎曲菌的最小抑菌濃度（ＭＩＣ）ＨＴＣＣ最小抑菌濃度測定結(jié)果（表１）顯示，隨著ＨＴＣＣ溶液濃度的增大，對空腸彎曲菌的抑菌效果明顯提高。ＨＴＣＣ溶液濃度≥１ ｍｇ／ｍＬ，對空腸彎曲菌有抑菌效果，濃度為８ ｍｇ／ｍＬ時可以完全抑制其生長，ＨＴＣＣ溶液對空腸彎曲菌的最小抑菌濃度（ＭＩＣ）為８ ｍｇ／ｍＬ。

２．１．３經(jīng)ＨＴＣＣ浸漬的無紡布的抑菌作用蒸餾水和ＨＴＣＣ溶液浸漬無紡布后，從無紡布的抑菌試驗(yàn)結(jié)果（圖２）可見，浸漬過ＨＴＣＣ溶液的無紡布的平板內(nèi)沒有細(xì)菌生長（圖２ｂ），具有抑菌效果；而浸漬過蒸餾水的無紡布的平板內(nèi)則有細(xì)菌生長（圖２ａ）?？梢姡龋裕茫镁哂辛己玫囊志?，可作為一種具有應(yīng)用潛力的抗菌劑。

２．２ＨＴＣＣ的ＦＴＩＲ表征

由殼聚糖和２－羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖的ＦＴＩＲ譜圖（圖３）可見，ＣＴＳ和ＨＴＣＣ都在 ３ ４０９ ｃｍ－１（－ＯＨ伸縮振動峰）、１ ０６５ ｃｍ－１（Ｃ－Ｏ伸縮振動峰）、１ １６３ ｃｍ－１（Ｃ－Ｎ伸縮振動峰）出現(xiàn)了多糖骨架的特征吸收峰。在ＨＴＣＣ的紅外譜圖中，殼聚糖在１ ５７７ ｃｍ－１處伯氨基的Ｎ－Ｈ面內(nèi)彎曲振動吸收峰消失，而在１ ４８６ ｃｍ－１、１ ６４８ ｃｍ－１、３ ０27 ｃｍ－１處出現(xiàn)了新的吸收峰，分別為季銨鹽化基團(tuán)中－ＣＨ３的變形振動峰和伸縮振動峰，表明殼聚糖分子中－ＮＨ２中的Ｈ已經(jīng)被－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３Ｃｌ－基團(tuán)部分取代并生成了２－羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖［６－８］。

２．3１ＨＮＭＲ表征

從ＨＴＣＣ的１Ｈ－ＮＭＲ譜圖（圖４）可見，在３．２０３ １處出現(xiàn)了引進(jìn)的季銨鹽支鏈基團(tuán)中３個甲基（Ｃ４）上的Ｈ的峰，４．５１１ ３對應(yīng)于吡喃苷雜環(huán)Ｃ１上的Ｈ，而在２．７６７ ２、４．３０１ ４、３．３９２ ５處出現(xiàn)的峰分別對應(yīng)于所引進(jìn)的季銨鹽支鏈基團(tuán)上的Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３上的Ｈ，２．５３１１、３．６０７３、３．６９５９、３．７５７３分別對應(yīng)于雜環(huán)中的Ｃ２、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ６上的Ｈ，這些數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［６－８］中用ＧＴＭＡＣ改性劑對殼聚糖進(jìn)行接枝改性得到的殼聚糖季銨化衍生物的１Ｈ－ＮＭＲ譜圖中的數(shù)據(jù)相近。可見2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖為殼聚糖Ｃ２位氨基上發(fā)生取代反應(yīng)的產(chǎn)物。

３結(jié)論

利用環(huán)氧活性基團(tuán)與殼聚糖分子中的氨基反應(yīng)，生成ＣＴＳ衍生物ＨＴＣＣ，試驗(yàn)驗(yàn)證了ＨＴＣＣ的抑菌效果。結(jié)果表明，ＨＴＣＣ對空腸彎曲菌和大腸桿菌具有抑菌作用，其抑菌率隨作用時間的延長而提高；ＨＴＣＣ對空腸彎曲菌的抑菌效果較好，其最小抑菌濃度為８ ｍｇ／ｍＬ，說明ＨＴＣＣ可作為一種具有應(yīng)用潛力的抗菌劑。

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