張紅艷，李彥姝，姚遠(yuǎn)，王春玉，王迪，李豐

(1．中國醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室，衛(wèi)生部細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，教育部醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽 110001;2．遼寧省人民醫(yī)院 消化內(nèi)科，遼寧 沈陽 110016)

LIM基因是指含有LIM結(jié)構(gòu)域的一大類基因，LIM結(jié)構(gòu)域含有大約55個(gè)氨基酸，由兩個(gè)串聯(lián)的可與鋅結(jié)合的富含半胱氨酸的基元組成，調(diào)節(jié)包括LIM同源異形蛋白在內(nèi)多種蛋白之間的相互作用［1］?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)該家族基因主要有 LMO1、LMO2、LMO3、LMO4、dLMO、XLMO、PDLP 等［2］。含有 LIM 結(jié)構(gòu)域的蛋白稱為LIM蛋白，哺乳動(dòng)物L(fēng)MO蛋白家族共有4個(gè)(LMO1～4)，缺少DNA結(jié)合域，但是依然能夠招募包括轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)的很多蛋白，執(zhí)行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的功能［3］。

Kenny等用NL1的LID結(jié)構(gòu)域篩選鼠胚的λ表達(dá)文庫分離鑒定了LMO4，是LIM轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子亞家族LMO中的新成員，在T淋巴細(xì)胞、腦神經(jīng)脊細(xì)胞、體節(jié)、背側(cè)肢芽間充質(zhì)細(xì)胞、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和施萬細(xì)胞前體細(xì)胞中高表達(dá)，在胚胎發(fā)育中有著重要的調(diào)節(jié)作用［1］。LMO4在決定細(xì)胞命運(yùn)及腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮著重要的作用。LMO4作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，在前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等上皮來源的腫瘤中高表達(dá)［3-5］。但是人 LMO4(hLMO4)基因，位于染色體1p22.3上［6］，在一些人類的癌癥中這一區(qū)域被刪除掉了，例如，肝癌、皮膚癌、肺癌［7-8］。因此 Setogawa等認(rèn)為LMO4可能執(zhí)行腫瘤抑制因子的功能［9］。在本研究中旨在利用基因重組技術(shù)構(gòu)建LMO4的原核表達(dá)載體，并鑒定其在E．coli BL21中的誘導(dǎo)表達(dá)，為進(jìn)一步研究LMO4的生物學(xué)功能奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1． 1 材料

原核表達(dá)載體pGEX-5X-1購自美國Clentech公司;大腸桿菌DH5α和BL21為本實(shí)驗(yàn)室保存;Pyrobest TM DNA polymerase，dNTP，DNA電泳凝膠回收試劑盒，限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ均購自大連TaKaRa公 司;DNA marker、Proteinmarker購 自GenScript公司;T4 DNA連接酶購自NEB公司;DNA測(cè)序測(cè)定由上海生工生物工程有限公司完成;異丙基硫代β-D半乳糖苷(IPTG)為Amresco產(chǎn)品;GST抗體購自Cell Signal公司，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;ECL發(fā)光試劑盒購自GE Healthcare公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1． 2 hLMO4原核表達(dá)載體的構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)室通過提取乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)RNA，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)獲得hLMO4全長編碼序列［10］，分別用BamHⅠ和 XhoⅠ雙酶切pGEX-5X-1載體和hLMO4 PCR片段后，凝膠回收純化產(chǎn)物［11］。將兩個(gè)片斷用T4 DNA連接酶常溫連接2 h，然后16℃連接過夜，得到連接產(chǎn)物。取5 μl轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E．coli DH5α中，37℃培養(yǎng)過夜。挑取菌落，接種于3 ml含氨芐西林的Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜。用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，質(zhì)粒DNA送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序分析，經(jīng)測(cè)序正確后將構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pGEX-5X-1-hLMO4。

1． 3 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pGEX-5X-1-hLMO4和pGEX-5X-1載體分別轉(zhuǎn)化E．coli BL21，涂布于含氨芐霉素的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜。挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落用堿裂解法制備質(zhì)粒DNA，經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定陽性克隆。將陽性克隆接種到含氨芐霉素LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜后，將菌液按1∶50接種到50 ml氨芐LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD 600為0.6左右時(shí)(3～4 h)，加入終濃度 1.0 mmol·L－1的IPTG，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h，收集細(xì)菌，加入50 μl 1倍稀釋的上樣緩沖液中，100 ℃加熱5 min，4 ℃、10 000 r·min－1離心5 min，冰上放置，取上清進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后觀察誘導(dǎo)結(jié)果。

1． 4 GST融合蛋白的純化

將pGEX-5X-1-LMO4和pGEX-5X-1陽性克隆接種到含有氨芐霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜后將2 ml過夜菌接種到100 ml LB培養(yǎng)基中，37℃搖菌3 h后加入IPTG，再30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h。4℃ 7 000 r·min－1收集細(xì)菌，用2 ml細(xì)菌裂解液充分重懸細(xì)菌，超聲破碎30 s，冰上孵育30 min，4 ℃、10 000 r·min－1離心5 min。取上清加入 GST-beads，4℃旋轉(zhuǎn)孵育 3 h，4℃、500 r·min－1離心2 min。收集 GST-beads，使用 NP-40緩沖液清洗GST-beads 3次，每次10 min，然后加入與GST-beads等體積的NP-40緩沖液。取10 μl純化蛋白，加入2倍稀釋的上樣緩沖液，100℃加熱5 min，4 ℃、10 000 r·min－1離心5 min，冰上放置，取上清進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后觀察純化蛋白表達(dá)。

1． 5 Western blot檢測(cè)

將誘導(dǎo)表達(dá)蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠分離，4℃40 V恒壓轉(zhuǎn)膜過夜，用5%脫脂奶粉常溫封閉1 h［12］，加入 anti-GST 抗體(1∶2 000)，室溫孵育 2 h，TBST洗膜3次，每次15 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次15 min。ECL顯色觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2． 1 hLMO4重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

重組質(zhì)粒pGEX-5X-1-hLMO4經(jīng) BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后得到約4 900 bp和500 bp左右的兩條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)，并經(jīng)測(cè)序鑒定正確，無移碼突變。

圖1 重組質(zhì)粒pGEX-5X-1-hLMO4酶切分析Lane 1．Lambda DNA marker;Lane 2，3，4．Recombinant plasmid pGEX-5X-1-hLMO4 digested by BamHⅠ and XhoⅠFig 1 Restriction enzyme digestion analysis of the recombinant plasmid pGEX-5X-1-hLMO4

2． 2 原核表達(dá)質(zhì)粒在E．coli中的誘導(dǎo)表達(dá)

構(gòu)建融合表達(dá)質(zhì)粒pGEX-5X-1-hLMO4在BL21 E．coli中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，在大約49 000 Da處出現(xiàn)一條明顯的特異性蛋白條帶(圖2)。

圖2 SDS-PAGE電泳分析GST-hLMO4在E．coli BL21中誘導(dǎo)表達(dá)Lane 1，3．Without IPTG induced pGEX-5X-1-hLMO4;Lane 2，4．IPTG induced pGEX-5X-1-hLMO4;Lane 5．Protein molecular weight markerFig 2 SDS-PAGE analysis of induction expression of GST-hLMO4 fusion protein in E．coli BL21

2． 3 原核表達(dá)質(zhì)粒在E．coli中的誘導(dǎo)純化IPTG-5X-1-5X-1-hL

誘導(dǎo)pGEX和pGEXMO4在BL21 E．coli中大量表達(dá)，利用 GST-beads對(duì) GST及GST-hLMO4融合蛋白進(jìn)行純化(圖3)。1列為蛋白分子量標(biāo)記，在蛋白標(biāo)準(zhǔn)50 kDa所在位置，﹡處出現(xiàn)明顯的特異性蛋白條帶(49 000 Da)，是GST(26 000 Da)與LMO4(23 000 Da)分子質(zhì)量之和，﹡指示純化的GST-hLMO4融合蛋白。

圖3 SDS-PAGE電泳分析GST和GST-hLMO4在E．coli BL21中誘導(dǎo)純化Lane 1．Protein molecular weight marker;Lane 2．the purification of GST-hLMO4 protein;Lane 3．the purification of GST proteinFig 3 SDS-PAGE analyse the purification of GST and GST-hLMO4 fusion protein in E．coli BL21

2． 4 Western blot鑒定融合蛋白的表達(dá)

使用anti-GST單克隆抗體進(jìn)行Western blot鑒定純化融合蛋白的表達(dá)(圖4)，﹡表示純化的GST-hLMO4，分子質(zhì)量大約為49 000 Da，1列代表陰性對(duì)照，為純化的GST蛋白，在相對(duì)應(yīng)的2列﹡位置上沒有蛋白表達(dá)。

圖4 使用anti-GST抗體對(duì)融合蛋白GST-hLMO4表達(dá)進(jìn)行Western blot檢測(cè)Lane 1．The purification of GST protein;Lane 2．The purification of GST-hLMO4 proteinFig 4 Western blot detect the expression of GST-hLMO4 fusion protein using anti-GST mAb

3 討 論

LMO4是由兩個(gè)串聯(lián)的不含有DNA結(jié)合域的LIM結(jié)構(gòu)域組成的，與多種蛋白相互作用，在多種蛋白復(fù)合體中扮演著橋梁因子的作用。它能夠?qū)⑤o抑制子(例如 MTA1、輔因子 CtIP 及 BRCA1［13］)招募到轉(zhuǎn)錄因子上，抑制轉(zhuǎn)錄活性。另外，LMO4通過招募活性因子或者減少招募輔抑制子來促進(jìn)轉(zhuǎn)錄活性，例如BMP7［14］。目前已經(jīng)證實(shí)，能與其發(fā)生相互作用的蛋白還包括核內(nèi)普遍存在的 Lbd1［15］、DEAF1［16］、HEN1［17］、Get-1［18］等。這些研究提示LMO4作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，在不同腫瘤中發(fā)揮著多重功能，一方面作為致癌基因促進(jìn)細(xì)胞增殖，另一方面作為腫瘤抑制子促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在哺乳動(dòng)物正常發(fā)育和腫瘤形成過程中起著重要的調(diào)控作用。

Racevskis等［19］發(fā)現(xiàn)LMO4是人類乳腺癌的一種自身抗原，可引起細(xì)胞增殖，增強(qiáng)細(xì)胞侵襲能力，從而直接導(dǎo)致乳腺細(xì)胞癌變。Sum等［13］報(bào)道，10種乳腺癌細(xì)胞株中，有5種細(xì)胞株LMO4 mRNA高表達(dá)，原位雜交檢測(cè)177例乳腺癌樣本，56%LMO4高表達(dá)。在口腔癌侵襲前沿LMO4表達(dá)上調(diào)，提示LMO4在癌癥細(xì)胞侵襲中扮演重要角色［20］。與非腫瘤的胰腺導(dǎo)管細(xì)胞株相比，14種胰腺癌細(xì)胞株中，有9株高表達(dá)LMO4，原代培養(yǎng)的胰腺成纖維細(xì)胞也高表達(dá)LMO4［3］。

本研究中采用pGEX-5X-1原核表達(dá)載體，此類載體含有高效的原核表達(dá)啟動(dòng)子，能夠在E．coli體內(nèi)高效表達(dá)重組蛋白。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了pGEX-5X-1-hLMO4表達(dá)質(zhì)粒，并建立GST-hLMO4體外純化表達(dá)系統(tǒng)，利用體外純化蛋白可進(jìn)行生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，例如GST pull-down驗(yàn)證蛋白相互作用，體外激酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證磷酸化等，為深入探討LMO4在腫瘤中的生物學(xué)作用提供了可靠的研究手段和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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