張改清 楊曼曼 席小莉 楊 頻

(1山西大學分子科學研究所，化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，太原 030006)

(2呂梁高等?？茖W?；瘜W化工系，呂梁 033000)(3山西大學化學化工學院，太原 030006)

表柔比星-鎂體系與DNA相互作用初步研究

張改清2楊曼曼3席小莉＊,1楊 頻1

(1山西大學分子科學研究所，化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，太原 030006)

(2呂梁高等?？茖W?；瘜W化工系，呂梁 033000)(3山西大學化學化工學院，太原 030006)

表柔比星是臨床上用于治療快速增殖腫瘤的藥物。本文應用紫外、熒光、圓二色、黏度、凝膠電泳等方法研究了表柔比星-Mg2+體系與DNA的作用。結果發(fā)現(xiàn)：在pH=7.4時，表柔比星可與Mg2+形成穩(wěn)定體系。加入DNA后表柔比星-Mg2+體系的紫外吸收明顯降低；Scatchard圖表明表柔比星-Mg2+體系對溴化乙錠(EB)與DNA的結合為競爭性抑制；同時此體系可使DNA-EB體系熒光偏振度增大；使DNA的熱變性溫度(Tm)上升；黏度增大；凝膠電泳表明表柔比星-Mg2+體系對pBR322DNA有非常好的切割活性；圓二色譜法表明隨著表柔比星-Mg2+體系的加入，DNA堿基間作用能迅速減弱，二級結構發(fā)生了顯著的變化。綜上所述：表柔比星-Mg2+體系與DNA之間為嵌插作用；且表柔比星-Mg2+體系具有更好的切割活性。這些結果，可為合理改善藥效和設計新藥提供依據。

表柔比星-Mg2+體系；CT DNA；Scatchard圖

新型抗癌藥劑的開發(fā)和抗癌機理研究，一直是人們爭相研究的前沿課題[1-5]。而許多治療癌癥的藥物大都是以DNA為靶分子來設計的[6-7]。全面了解與掌握活性小分子和DNA的作用，對藥物的設計具有指導作用。表柔比星是一種新的蒽環(huán)類抗生素，具有廣譜抗腫瘤活性。細胞培養(yǎng)研究表明，該藥可迅速透入細胞，進入細胞核，抑制核酸的合成和有絲分裂，常用于治療包括L1210和P388白血病、肉瘤SA180(團塊性，腹水型)、淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、胃癌，黑色素瘤B16、乳腺癌、路易斯肺癌以及結腸癌38等。在前面的文章中我們課題組研究了表柔比星銅體系與DNA的作用[8]，本文應用光譜等手段研究了表柔比星-Mg2+體系與小牛胸腺DNA的作用，發(fā)現(xiàn)生命金屬鎂與表柔比星形成的穩(wěn)定體系能夠與DNA發(fā)生作用，并引起其一系列的性質變化。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

Varian 50bio型紫外分光光度計；Perkin-Elmer LS-50B型熒光光譜儀；Shimadzu FTIR8400S光譜儀，KBr壓片；Biologic MOS-450圓二色譜儀；Ubbelodhe黏度計；BECKMANΦ50pH計；小牛胸腺DNA(華美生物工程公司)，溶液純度以A260nm/A280nm＞1.8衡量，濃度以260 nm處的吸光度來確定(ε=6 600 L·mol-1·cm-1)，于 4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫痪彌_液由0.1 mol·L-1Tris溶液和 0.1 mol·L-1鹽酸配制 (pH=7.2)；溴化乙啶 (EB)(舒伯韋公司)；鹽酸表柔比星(Epirubicin，Scheme 1)由濟南富創(chuàng)醫(yī)藥科技有限公司提供純品(含量不低于99%),其化學名為(7S∶9S)-9-羥乙?；?4-甲氧基-7，8，9，10-四氫-6，7，9，11-四羥基-7-O-(2，3，6-三去氧-3-氨基-α-L-阿拉伯吡喃糖基)-5，12-萘二酮鹽酸鹽；pBR322 DNA購自寶生物工程(大連)有限公司，pBR322 DNA為應用最廣的質粒DNA，是分子克隆技術中的重要載體呈共價閉合環(huán)狀超螺旋狀態(tài)，長度為4363 bp,分子量為2.88×106Da。本次實驗所用pBR322 DNA純度符合兩個要求(1)含70%以上的雙鏈Covalently closed circular form Ⅰ(RFI)；(2)在 TE Buffer(pH 8.0)條件下：A260nm/A280nm≥1.8。其他試劑均為國產分析純試劑。

Scheme 1 表柔比星(Epirubicin)結構式

1.2 實驗方法

1.2.1 表柔比星-Mg2+體系的吸收光譜特征

1.2.1.1 表柔比星-Mg2+體系的制備及其紅外、吸收光譜特征

將MgCl2和藥物表柔比星(Epirubicin)分別配成1×10-4mol·L-1的溶液，然后將表柔比星溶液逐滴滴加入MgCl2溶液中，在一定酸度及波長條件下，測定溶液的吸光度。將所得吸光度對cR/cM作圖。當藥物的量較小時，金屬離子沒有被完全配合。隨著藥物的量逐漸增加，金屬離子與藥物配合、直至飽和，這時藥物的量再增多吸光度也不會增大。運用外推法得一交點，從交點向橫坐標作垂線，對應的cR/cM比值就是表柔比星鎂體系的配合比n。實驗發(fā)現(xiàn)在pH=7.4時Mg2+可與表柔比星形成1∶1的穩(wěn)定體系(以下簡寫為Epirubicin-Mg2+system)；同時采用連續(xù)變化法作對照，測定了此體系的表觀摩爾吸光系數(shù)，表觀穩(wěn)定常數(shù)及組成比，其具體數(shù)據見表1，可見兩者都支持Mg2+和表柔比星可形成1∶1的穩(wěn)定體系；進而應用分子模擬優(yōu)化得到如圖1示出的配位形式。

由圖2可看出，表柔比星在 3 427.632 cm-1處的峰值經過與鎂作用后變?yōu)? 416.667 cm-1；在1 633.771 cm-1處 的 峰 變 為 1 640.351 cm-1；在1407.895 cm-1處的峰值變?yōu)?1429.825 cm-1；以上結果表明表柔比星與Mg2+結合后，C=O、-OH峰均發(fā)生了一定的變化。同時，在 1537.281 cm-1及 673.112cm-1處又出現(xiàn)了2個新的峰，其中673.112 cm-1處的峰有可能是金屬與配合物中的配位鍵M-L所產生的振動[9]。

表1 表柔比星鎂體系的有關參數(shù)Table 1 Parameter of Epirubicin metal system

圖1 最優(yōu)化的表柔比星-Mg2+體系的結構Fig.1 Optimized structure of the Epirubicin-Mg2+system

圖2 表柔比星及表柔比星-Mg2+體系的IR光譜圖Fig.2 IR spectra of Epirubicin(a)and Epirubicin-Mg2+(b)

1.2.1.2 表柔比星及表柔比星-Mg2+體系與DNA的吸收光譜

以緩沖溶液作為空白對照液，樣品池為表柔比星或表柔比星-Mg2+，濃度 c 均固定為 15 μmol·L-1，然后向此樣品池中逐次加入DNA溶液，使得在室溫下，反應30 min后，進行紫外掃描。

1.2.2 Scatchard圖及熒光偏振度

在熒光測定中,固定 DNA 濃度為 2.5 μmol·L-1，逐次滴加表柔比星及表柔比星-Mg2+體系，使得室溫下，反應30 min后，再將100 μg·mL-1EB溶液加入上述表柔比星及表柔比星-Mg2+體系，激發(fā)波長520 nm,狹縫寬度6 nm，測定其熒光發(fā)射譜。數(shù)據按Scatchard方程[10]處理，以r/c對r作圖(r是與DNA分子中每個核苷酸成鍵的EB分子數(shù)，c是游離EB的濃度)。

在熒光偏振度測定中，固定EB-DNA濃度為2.5 μmol·L-1，使得表柔比星及表柔比星-Mg2+體系的濃度分別為9,12,15,18，21，24，27。室溫下，反應 30 min 后，利用熒光儀的偏振功能,取激發(fā)波長520 nm，狹縫寬度6 nm，測定其熒光發(fā)射譜。數(shù)據按下式計算[11]

式中，P為偏振度，F(xiàn)VV和FVH分別為垂直偏振光激發(fā)下的垂直偏振發(fā)射光強度和水平偏振發(fā)射光強度；FHV和FHH分別為水平偏振光激發(fā)下的垂直偏振發(fā)射光強度和水平偏振發(fā)射光強度。

1.2.3 熱變性研究

配制DNA-EB溶液(cDNA/cEB=20)和DNA-EB-Epirubicin(cDNA/cEB=20，cEB=cEpirubicin)及 DNA-EB-(Epirubicin-Mg2+)(cDNA/cEB=20，cEB=cEpirubicin-Mg2+)溶液，在不同溫度下測定其熒光強度。

1.2.4 黏度測定

小牛胸腺DNA濃度固定為1 mmol·L-1，表柔比星及表柔比星-Mg2+體系濃度依次增大，溫度恒定在(28±0.1)℃，反應30 min后，進行測量。數(shù)據以(η/η0)1/3對表柔比星及表柔比星-Mg2+體系濃度作圖。η代表DNA在出現(xiàn)表柔比星及表柔比星-Mg2+體系時黏度，η0代表DNA單獨存在時的黏度。

1.2.5 表柔比星-Mg2+體系與質粒pBR322作用的電泳實驗

在 20 μL 5 mmol·L-1Tris-HCl(pH 7.40，5mmol·L-1NaCl)緩沖液中，加入一定體積(即不同濃度)的表柔比星及表柔比星-Mg2+和pBR322溶液，混勻，然后在37℃恒溫水浴中恒溫4 h，通過加入EDTA和溴酚藍終止反應，然后應用瓊脂糖凝膠電泳分析結果、從中選出表柔比星-Mg2+濃度為 1.0×10-5mol·L-1做時間梯度實驗, 體系恒溫分別為 0.5，1，2，4，6，8 h。然后應用瓊脂糖凝膠電泳分析結果(圖譜做為支持材料)，然后選出4 h為合適時間做羥基自由基清除劑實驗。

1.2.6 圓二色譜(CD)的測定

室溫下，取 2.5 mL 的 DNA(cDNA=2.59×10-4mol·L-1)溶液于一系列10 mL比色管中，然后依次加入不同體積的表柔比星及表柔比星-Mg2+體系溶液，定容后震蕩搖勻，測定圓二色譜；以相應的Tris-HCl緩沖溶液為參比溶液，樣品池為1 cm石英吸收池。

2 結果與討論

2.1 吸收光譜研究

圖3中a為表柔比星與DNA作用的紫外吸收光譜，b為表柔比星-Mg2+體系與DNA作用的紫外吸收光譜，每個圖中曲線1為表柔比星及表柔比星-Mg2+的紫外吸收光譜，曲線2～10為它們中加入DNA后的紫外吸收光譜，由圖可見當加入DNA后表柔比星-Mg2+的最大吸收峰強度減小。根據文獻報道[12-14],當小分子以嵌入方式結合于CT-DNA雙螺旋堿基對之間時，其吸收光譜表現(xiàn)出減色效應；當小分子以靜電方式結合于CT-DNA時，其吸收光譜表現(xiàn)出增色效應；因此，此時表柔比星-Mg2+與CT-DNA之間的相互作用應以嵌入方式為主。

圖3 表柔比星及表柔比星-Mg2+與DNA的紫外吸收譜Fig.3 UV absorption spectra of Epirubicin Epirubicin-Mg2+increasing concentration of DNA

2.2 Scatchard圖及熒光偏振度研究

2.2.1 表柔比星-Mg2+及表柔比星對DNA-EB抑制作用類型分析

利用表柔比星-Mg2+體系存在下DNA與EB作用的Scatchard圖，可判別表柔比星-Mg2+體系的作用方式[10]。每個圖中最右側線為單獨EB與DNA的Scatchard線。

圖4顯示，在不同濃度的表柔比星-Mg2+體系存在下，Scatchard圖是幾條不平行的直線。表明隨著表柔比星-Mg2+體系濃度的增大，DNA與EB的結合常數(shù)發(fā)生變化，因此，表柔比星-Mg2+體系與EB在DNA上的結合位點是竟爭型的。

圖4 不同濃度的表柔比星及表柔比星-Mg2+體系存在下DNA與EB作用的Scatchard圖Fig.4 Fluorescence Scatchard plots of increasing concentration of complex

2.2.2 表柔比星-Mg2+及表柔比星對DNA-EB體系熒光偏振度的影響

偏振熒光強度與分子轉動的速度成反比，復合物分子量大，旋轉慢，偏振熒光強；游離標記抗原的分子量小，偏振熒光弱。在粘度小的溶劑(如水)中，由于小分子旋轉擴散很快，其熒光偏振一般很小。而當小分子熒光體嵌入到DNA的堿基對中時，其轉動受阻，導致小分子轉動速度變慢，因而熒光偏振會隨之變大[15]。由圖5可以看出，表柔比星-Mg2+體系加入到DNA-EB體系中時，P值上升，這是由于表柔比星-Mg2+體系和EB競爭，使得少量EB從DNA分子中游離出來，從而使P值上升。

圖5 表柔比星及表柔比星-Mg2+體系對DNA-EB體系熒光偏振度的影響Fig.5 Fluorescence polarization of DNA-EB system increased with addition of the Epirubicin and Epirubicin-Mg2+system

2.3 CT-DNA的熱變性實驗

通過測定DNA的熱變性溫度(Tm),可以發(fā)現(xiàn)表柔比星-Mg2+體系與DNA的作用模式 (嵌插或外部鍵合)。若它們與DNA發(fā)生插入反應，將穩(wěn)定DNA的雙鏈結構,并使Tm急劇上升；若它們僅與DNA發(fā)生外部鍵合時，則Tm上升幅度較小或不上升[16]。在本實驗條件下，DNA的Tm為84℃。當DNA與表柔比星作用后,其Tm為86℃；當DNA與表柔比星-Mg2+體系作用后,其Tm為88.5℃。這表明表柔比星-Mg2+系的加入，增加了雙螺旋構象的穩(wěn)定性。

2.4 黏度研究

具有光學活性的光物理探針對于探討鍵合模式一般可以提供必要的但不是充分的證據[17]。在缺乏晶體數(shù)據的情況下，黏度測定一般被認為是確定鍵合模式最有力的證據之一[18]。從圖6可以看出，DNA與表柔比星及表柔比星-Mg2+體系相互作用后，黏度值均升高。黏度對分子長度變化非常敏感。當表柔比星-Mg2+體系以經典插入方式與DNA相互作用時，DNA相鄰堿基對的距離會增大以容納插入的表柔比星-Mg2+體系分子，導致DNA螺旋伸長，相應DNA黏度增加。DNA本身是一多聚陰離子，在溶液中，由于負電荷之間的相互靜電排斥，使DNA大分子較為伸展，而當表柔比星-Mg2+體系陽離子與DNA帶負電荷的磷酸氧基團以靜電作用結合時，使得DNA的負電荷被部分中和，導致DNA螺旋收縮，分子長度變小，相應DNA黏度降低。因此，圖6表明表柔比星及表柔比星-Mg2+體系均以插入方式與DNA相互作用。

圖6 表柔比星及表柔比星-Mg2+體系在不同的濃度下對DNA黏度的影響Fig.6 Effect of the increasing concentration of complex on the relative viscosity DNA

2.5 凝膠電泳分析

為了比較表柔比星及表柔比星-Mg2+體系與DNA的相互作用，設計了3個凝膠電泳實驗。在20 μL 5 mmol·L-1Tris-HCl(pH 7.40，5 mmol·L-1NaCl)緩沖液中，加入一定體積的表柔比星或表柔比星-Mg2+和pBR322溶液，混勻，然后在37℃恒溫水浴中恒溫4 h，通過加入EDTA和溴酚藍終止反應，然后應用瓊脂糖凝膠電泳分析結果,得圖7。圖7a為表柔比星切割pBR322DNA的凝膠電泳圖；圖7b為表柔比星-Mg2+體系切割pBR322DNA的凝膠電泳圖；圖7c為羥基自由基清除劑存在下表柔比星-Mg2+體系切割pBR322DNA的凝膠電泳圖；由圖7a可看出，當表柔比星濃度達到5 μmol·L-1時有線性出現(xiàn)，但不明顯,而當濃度達到20μmol·L-1時線性逐漸減弱，超螺旋DNA(formⅠ，CCC帶)又在逐漸增加；由圖7b可看出，當表柔比星-Mg2+體系達到5 μmol·L-1時有線性(form Ⅲ，linear帶)出現(xiàn)，當表柔比星-Mg2+體系達到 10 μmol·L-1時線性很明顯,并且隨著表柔比星-Mg2+體系濃度增大，線性逐漸增加,說明表柔比星-Mg2+體系具有較高的切割質粒DNA的活性。由圖7c可看出，當0.4 mol· L-1的DMSO，甘油或2.5 mol·L-1的甲醇加入到表柔比星-Mg2+與DNA的反應體系并溫育4 h，DNA的切割幾乎沒受影響(在切割誤差范圍內)。由此可見，反應沒有產生羥基自由基，推測表柔比星-Mg2+對質粒DNA的作用可能是水解切割。

圖7 表柔比星及表柔比星-Mg2+體系在不同的濃度下與pBR322DNA作用的電泳圖Fig.7 Results of electrophoresis of pBR322 DNA in the presence of varying concentrations of epirubicin and epirubicin-Mg2+system

2.6 CD譜分析

DNA的CD譜主要來自最鄰近的堿基間的相互作用，堿基間作用能的減小，意味著“堿基堆積力”變小了，堿基堆積變得疏松了[20-21]，因而可以用CD譜來觀察。表柔比星-Mg2+體系與DNA中相鄰的2個堿基結合后，有可能使原先平行的2個堿基平面相互傾斜,也可能改變堿基相互旋轉的角度,這樣,就破壞了原先堿基間極其規(guī)律的堆積方式，導致堿基堆積無規(guī)化，必然減少其相互作用能，使CD峰值改變，峰位移動。與此同時，表柔比星-Mg2+體系的作用也會使堿基間的距離，相對位置稍有改變，這種構型的變化也必然影響堿基的相互作用，使CD譜發(fā)生變化。

圖8a是CT-DNA溶液的CD光譜，位于277 nm的正峰是由堿基的堆積產生的，而245 nm的負峰則對應于DNA雙螺旋結構的B型構象。當向CTDNA溶液中加入表柔比星后(見圖8b)，DNA CD圖譜中的正負峰均發(fā)生了一定的變化，其中負峰的變化大于正峰；當向CT-DNA溶液中加入表柔比星-Mg2體系后(見圖8c)，正負峰也都發(fā)生了很大的變化，可以看出，圖8c的變化幅度要大于圖8b，堿基間作用能遞減，特別是245 nm處的負峰向正峰方向的移動的趨勢非常明顯，因而可以認為此DNA的構象有從B型DNA轉向A型DNA的趨勢[22]，即表柔比星-Mg2+體系的加入使得CT-DNA的二級結構發(fā)生了很大的變化。

圖8 表柔比星及表柔比星-Mg2+體系在不同的濃度下與CT-DNA作用的CD譜Fig.8 Effect of the increasing concentration of Epirubicin and Epirubicin-Mg2+on the CD

3 結 論

本文應用光譜法、粘度法、圓二色譜等方法研究了表柔比星-Mg2+體系與DNA的相互作用。結果表明：在pH=7.4時，表柔比星可與Mg2+形成穩(wěn)定體系。加入DNA后,表柔比星-Mg2+體系的紫外吸收明顯降低；Scatchard圖表明表柔比星-Mg2+體系對溴化乙錠(EB)與DNA的結合為競爭性抑制；同時此體系可使DNA-EB體系熒光偏振度增大；使DNA的熱變性溫度(Tm)上升；黏度增大；圓二色譜法表明隨著表柔比星-Mg2+體系的加入，DNA堿基間作用能迅速遞減。電泳結果表明：表柔比星-Mg2+體系能在10 μmol·L-1濃度下將pBR322DNA切割出明顯的線性。并且通過自由基捕捉劑4 h的溫育，未觀察到自由基產生。從而表明，表柔比星-Mg2+體系比單純的表柔比星具有良好的切割活性。綜合以上實驗現(xiàn)象得出：表柔比星-Mg2+體系與DNA之間為嵌插作用；同時此體系對pBR322DNA有非常好的切割活性；另外它還能使DNA堿基間作用能迅速遞減，使DNA的二級結構發(fā)生變化，即有可能使DNA的構象由B型轉向A型。這些結果，可為合理改善藥效和設計新藥提供依據，為從分子水平上探討藥物及表柔比星-Mg2+體系抗腫瘤活性不同的成因及其與DNA作用方式之間的聯(lián)系提供了有價值的信息。

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Preliminary Research on the Interaction between Epirubicin-Mg2+System and DNA

ZHANG Gai-Qing2YANG Man-Man3XI Xiao-Li＊,1YANG Pin1
(1Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering(MOE),Institute of Molecular Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)
(2Department of Chemistry,Lüliang High Technological Academy,Lüliang,Shanxi 033000,China)
(3College of Chemistry and Chemical Engineering,Shanxi University;Taiyuan 030006,China)

Epirubicin is used to treat the fast multiplication cancer.The interaction of Epirubicin-Mg2+system with calf thymus DNA has been investigated using UV spectra,fluorescent spectra,CD,viscosity and gel electrophoresis etc.The results show that,Epirubicin can form constant system with Mg2+in pH=7.4 solution.Hypochromism was observed in the UV spectra of the system in the presence of the DNA.The Scatchard plots showed competitive inhibition aganist EB binding to DNA.The relative viscosity and thermal deformation temperature of DNA increased with addition of the Epirubicin-Mg2+system.The fluorescence polarization of the DNA-EB system increased with addition of the Epirubicin-Mg2+system.Then the interaction of the Epirubicin-Mg2+system with pBR322 was studied by the method of gel electrophoresis.The result showed that the Epirubicin-Mg2+system could cleave pBR322 DNA very effectively.The energy of base pair has been weakened with addition of the Epirubicin-Mg2+system.So it can be concluded that the binding mode of the Epirubicin-Mg2+system with CT DNA belongs to intercalation action.This work may be usefully applied to elucidating the mechanisms of natural nucleases and drug design.

epirubicin-Mg2+system;calf thymus DNA;Scatchard plot

O614.22

A

1001-4861(2011)01-0079-08

2010-06-21。收修改稿日期：2010-09-28。

國家自然科學基金資助項目(No.20971081)。

＊通訊聯(lián)系人。E-mail：wanghaiyan@sxu.edu.cn，Tel：13700501823