王 莉 魏麗梅 張 勇,2 裴亞梅

(1華中師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，武漢 430079)(2黃石理工學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，黃石 435003)

配合物[Mn(EDTB)](NO3)2·DMF的合成、晶體結(jié)構(gòu)及多酚氧化酶(PPO)活性的研究

王 莉＊,1魏麗梅1張 勇1,2裴亞梅1

(1華中師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，武漢 430079)(2黃石理工學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，黃石 435003)

合成六齒配體 N，N，N′，N′-四(2-苯并咪唑亞甲基)-1，2-乙二胺(EDTB)及單核錳(Ⅱ)配合物[Mn(EDTB)](NO3)2·DMF，并進(jìn)行了晶體結(jié)構(gòu)和多酚氧化酶(PPO)模擬活性研究。該配合物為正交晶系，P212121空間群，a=1.172 52(6)nm，b=1.320 83(6)nm，c=2.46191(12)nm，V=3.8128(3)nm3，Dc=1.451 g·cm-3，Z=4，F(xiàn)(000)=1732。最終因子 R(I＞2σ(I))：R1=0.0522，wR2=0.1022；R(全部數(shù)據(jù))：R1=0.0652，wR2=0.1075，F(xiàn)lack 指數(shù)為 0.02(15)。結(jié)構(gòu)分析表明，錳(Ⅱ)分別與配體 EDTB 苯并咪唑環(huán)的 4 個(gè)氮原子、兩個(gè)亞胺基氮原子發(fā)生配位，形成1個(gè)變形八面體結(jié)構(gòu)。采用分光光度法研究配合物的多酚氧化酶活性，以鄰苯三酚為底物，表明在0.1～10 μmol·L-1范圍內(nèi)，隨著配合物濃度逐漸增大，配合物的氧化促進(jìn)率從 51.5%增至 82.2%。在 30 ℃，pH=7.8～8.2 條件下，配合物的轉(zhuǎn)化數(shù)由22.93 h-1增加到51.01 h-1，說明配合物的PPO活性隨著pH值的升高而明顯增強(qiáng)。

錳(Ⅱ)配合物；EDTB；晶體結(jié)構(gòu)；PPO活性。

0 引 言

多酚氧化酶(PPO)是一種廣泛分布在微生物，植物和動(dòng)物體內(nèi)的氧化還原酶[1]。生物體內(nèi)PPO酶兒茶酚的活性部位含雙核銅，兩個(gè)銅離子被羥基橋連，間距為0.287 nm，每個(gè)銅離子另外與3個(gè)組氨酸咪唑氮配位，形成四配位的四面體結(jié)構(gòu)[2]。多酚氧化酶與植物的抗病性有關(guān)，植物在抵御病原微生物的侵染過程中，病原相關(guān)蛋白家族PPO和酚類代謝系統(tǒng)中的一些酶通過催化木質(zhì)素及醌類化合物的形成，構(gòu)成保護(hù)性屏蔽而使細(xì)胞免受病菌的侵害，也可以通過形成醌類物質(zhì)直接發(fā)揮抗病作用[3]。此外，在工業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，PPO的作用直接影響食品、飲料的色澤及品質(zhì)，特別是在制作綠茶、紅茶、烤煙和水果類飲料的過程中更為突出[4-5]。多酚氧化酶一直是研究的熱點(diǎn)，其生化、生理學(xué)性質(zhì)方面已取得了較大的進(jìn)展。

本文選擇六齒配體 N，N，N′，N′-四(2-苯并咪唑亞甲基)-1，2-乙二胺(C34H32N10，EDTB)為配體，合成錳-EDTB配合物作為PPO的模型配合物。采用X-射線衍射法測定了其晶體結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行了元素分析、紅外光譜、紫外光譜表征。采用分光光度法研究配合物的多酚氧化酶活性，以鄰苯三酚為底物，表明在 0.1～10 μmol·L-1范圍內(nèi)，隨著配合物濃度逐漸增大，配合物的氧化促進(jìn)率從51.5增至82.2%.在30 ℃，pH=7.8～8.2 條件下，配合物的轉(zhuǎn)化數(shù)由 22.93 h-1增加到51.01 h-1，說明配合物的PPO活性隨著pH值的升高而明顯增強(qiáng)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

試劑均為市售分析純。Perkin-Elmer 2400型元素分析儀；JEAN-Specord 210型紫外可見分光光度計(jì)；NEXUS智能型高分辨率傅里葉紅外光譜儀；WS70-1紅外線快速干燥器；Brucker AXS SMART 1000 CCD單晶衍射儀。

1.2 EDTB配體的合成

依據(jù)文獻(xiàn)方法[6-7]，稱取乙二氨四乙酸(EDTA)14.6 g，鄰苯二胺質(zhì)量 21.7 g(二者物質(zhì)的量比 1∶4)，然后加入乙二醇溶劑50～60 mL，160℃油浴反應(yīng)約6 h，直到無水蒸氣放出為止?？s合產(chǎn)物冷卻至120℃倒入燒杯，邊攪拌邊加入200 mL蒸餾水。冷卻至室溫，變粘稠，加入適量無水乙醇，靜置過夜。過濾得到紫紅色粗產(chǎn)品，然后將粗產(chǎn)品用50 mL 95%乙醇重結(jié)晶2～3次得到粉紅色固體產(chǎn)物，用少量丙酮洗滌，得到淡粉色固體粉末 21.9 g，產(chǎn)約 75.5%。

1.3 配合物的合成

稱取提純后的 EDTB(0.58 g，1 mmol)粉末溶解于20 mL甲醇與DMF混合液中，然后在60℃攪拌下加入 Mn(NO3)2·4H2O(0.18 g，1 mmol)水溶液，反應(yīng)2 h，冷卻過濾，得到淡黃色溶液。將溶液靜置于室溫下數(shù)周后析出淺棕色方形單晶。Anal.Calcd.for C37H39MnN13O7(%)：C 53.33，N 21.81，H 4.62；Found(%)：C 53.13，N 21.79，H 4.60。

配合物的紫外-可見吸收光譜顯示在275 nm處有苯并咪唑環(huán)π-π*躍遷。配合物的紅外吸收光譜是以KBr壓片，在3800～3000 cm-1范圍內(nèi)強(qiáng)而寬的吸收峰帶歸屬為芳環(huán)上νC-H和νN-H；2 920 cm-1附近的峰可歸屬為亞甲基(-CH2-)的振動(dòng)吸收；1630～1655 cm-1歸屬為 νC=O；1620 及 1 450 cm-1附近兩個(gè)吸收峰可以歸屬為苯環(huán)骨架振動(dòng)吸收峰 (νC=H)；745 cm-1歸屬為芳環(huán)上C-H的面外彎曲振動(dòng)或NH的非平面振動(dòng)；在遠(yuǎn)紅外270～290 cm-1歸屬為烷氨氮與金屬配位的νM=N特征振動(dòng)峰。

1.4 晶體結(jié)構(gòu)的測定和結(jié)構(gòu)解析

選擇尺寸大小為 0.30 mm×0.20 mm×0.20 mm 的淺棕色方形單晶，在室溫295(2)K下，置于Brucker AXS SMART 1000 CCD單晶衍射儀上，用石墨單色器單色化的 Mo Kα 輻射(λ=0.71073)和 φ/ω 掃描方式最終的差值傅立葉圖上，共收集到29628個(gè)衍射點(diǎn)，獨(dú)立衍射點(diǎn) 8316 個(gè)，其中 6876 個(gè)(I＞2σ(I))衍射點(diǎn)用于結(jié)構(gòu)精修。晶體結(jié)構(gòu)分析采用SHELXL程序完成，氫原子坐標(biāo)通過理論加氫程序得到。所有氫原子均采用各向同性熱參數(shù)，非氫原子采用各向異性熱參數(shù)。對原子坐標(biāo)和熱參數(shù)用全矩陣最小二乘法進(jìn)行了修正，并用PLATON程序繪出化合物的晶體結(jié)構(gòu)圖。配合物[Mn(EDTB)](NO3)2·DMF為正交晶系，P212121空間群，a=1.17252(6)nm，b=1.32083(6)nm，c=2.46191(12)nm，V=3.8128(3)nm3，Dc=1.451 g·cm-3，Z=4，F(xiàn)(000)=1732，F(xiàn)lack 指數(shù)為 0.02(15)。最終殘差因子 R1=0.0522，wR2=0.1022。最終的差值傅立葉圖上，最高電子密度峰為452 e·nm-3，最低電子密度峰為 -277 e·nm-3。晶體學(xué)數(shù)據(jù)和精修參數(shù)見表1，鍵長和鍵角見表2，氫鍵數(shù)據(jù)見表3。

CCDC：771022。

表1 配合物的晶體學(xué)數(shù)據(jù)和精修參數(shù)Table 1 Crystal data and structure refinement for the complex

表2 配合物[Mn(EDTB)](NO3)2·DMF部分的鍵長和鍵角Table 2 Selected bond lengths(nm)and angles(°)of[Mn(EDTB)](NO3)2·DMF

表3 [Mn(EDTB)](NO3)2·DMF的氫鍵數(shù)據(jù)Table 3 Hydrogen bond data for[Mn(EDTB)](NO3)2·DMF

1.5 配合物的PPO活性實(shí)驗(yàn)

分光光度法測定多酚氧化酶的活性，因操作簡易、方便、快速，被廣泛采用。PPO活性的測定可采用多種底物，主要有鄰苯二酚、鄰苯三酚、酪氨酸、氯原酸、多巴及多巴胺[8]。通過對比和篩選，本實(shí)驗(yàn)采用鄰苯三酚為測試底物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為敏感和穩(wěn)定。

在 pH=8.2，Tris-HCl 5.0 mL 的緩沖液中分別加入雙蒸水 4.7，4.5，4.3，3.9，3.7，3.2 mL 和模型配合物(30 μmol·L-1)0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5 mL，搖勻后在30℃水浴中恒溫10 min，立即加入30℃恒溫的鄰苯三酚 0.3 mL，4.0 mmol·L-1并混勻，迅速轉(zhuǎn)入1 cm石英比色皿中，1 min后開始測定，并每隔30 s分別記錄體系在320 nm處的吸光度，共測定9～11個(gè)點(diǎn)。

在 5.0 mL，0.1 mol·L-1Tris-HCl的緩沖液 (pH=7.8，8.0，8.2)中分別加入 4.5 mL 雙蒸水和 0.2 mL 模型配合物(濃度為 30 μmol·L-1)，搖勻后在 30 ℃水浴中恒溫10 min，立即加入30℃恒溫的鄰苯三酚0.30 mL(濃度為 4.0 mmol·L-1)混勻，迅速轉(zhuǎn)入 1 cm石英比色皿中，立即開始測定，每隔30 s分別記錄體系在320 nm處的吸光度，共測定9～11個(gè)點(diǎn)，然后每隔1 min測定1次，直到吸光度不再發(fā)生變化，并記錄最大值。

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物的晶體結(jié)構(gòu)

配合物中錳(Ⅱ)分別與來自EDTB分子的4個(gè)苯并咪唑氮原子(N(3)，N(5)，N(2)，N(9))和 EDTB 分子的2個(gè)亞胺基氮原子(N(1)，N(7))配位，形成1個(gè)六配位的扭曲八面體結(jié)構(gòu)、DMF游離在外界。Mn2+離子周圍的配位環(huán)境上 N(2)，N(3)，N(5)，N(9)處于赤道位置，而N(1)，N(7)處于軸向位置。標(biāo)題配合物晶體的主要鍵長和鍵角列于表2，標(biāo)題化合物的不對稱單元橢球圖見圖1。從表2可知，亞胺基氮原子與 Mn2+之間的距離(Mn(1)-N(1)0.237 8(2)nm，Mn(1)-N(2)0.238 8(2)nm)長于苯并咪唑氮原子與Mn2+離子之間的距離(Mn(1)-N(3)0.216 1(2)nm，Mn(1)-N(5)0.2229(2)nm，Mn(1)-N(7)0.216 1(2)nm，Mn(1)-N(9)0.2228(2)nm)，這與苯并咪唑失去 H+帶負(fù)電荷的氮離子給電子的能力比亞胺基氮原子給電子能力強(qiáng)的事實(shí)相符合。標(biāo)題配合物中處于軸向位置的 N(1)與處于赤道位置的 N(3)，N(9)，N(5)，N(2)的鍵角大小分別為∠N(3)-Mn(1)-N(1)=75.71(8)°，∠N(9)-Mn(1)-N(1)=75.51(9)°，∠N(1)-Mn(1)-N(2)=76.68°，∠N(5)-Mn(1)-N(1)=89.61(8)°，前 3 個(gè)角偏離90°，而后1個(gè)角接近90°。處于軸向位置的N(7)與處于赤道位置的 N(1)，N(2)，N(9)，N(3)的鍵角大小分別為∠N(7)-Mn(1)-N(5)=94.49(9)°，∠N(7)-Mn(1)-N(9)=92.60(9)°，∠N(7)-Mn(1)-N(2)=75.59(9)°，∠N(3)-Mn(1)-N(7)=134.01(9)°，前 2 個(gè)角接近 90°，而后 2 個(gè)角偏離90°。3對處于對角位置的氮原子鍵角大小為：∠N(7)-Mn(1)-N(1)=149.78(9)°；∠N(3)-Mn(1)-N(2)=148.79(8)°；∠N(9)-Mn(1)-N(5)=160.81(9)°，3 個(gè)角均偏離180°。標(biāo)題配合物中心錳(Ⅱ)離子與與配合物[Mn(EDTB)Cl]Cl·H2O[8]，[Mn(EDTB)(Ac)]Ac·EtOH[9]，[Mn(EDTB)(PhCOO)]ClO4·EtOH·H2O[10]的中心金屬錳(Ⅱ)離子的配位模式不同。這是因?yàn)榕浜衔颷Mn(EDTB)](NO3)2·DMF中心金屬錳(Ⅱ)離子與來自EDTB分子的4個(gè)苯并咪唑氮原子和EDTB分子的2個(gè)亞胺基氮原子配位，形成1個(gè)六配位的扭曲八面體結(jié)構(gòu)，而其他3個(gè)配合物中心金屬錳(Ⅱ)離子只與配體EDTB分子的3個(gè)苯并咪唑氮原子和EDTB分子的2個(gè)亞胺基氮原子配位，同時(shí)與1個(gè)小分子配體配位形成六配位或者七配位的結(jié)構(gòu)。另外，標(biāo)題化合物中心錳離子的幾何構(gòu)型與近期報(bào)道的單晶 [Zn(EDTB)](NO3)2·C2H5OH[11]，[Cu(EDTB)](NO3)2·C2H5OH[12]，[Ni(EDTB)](NO3)2·C2H5OH[13]的中心離子的幾何構(gòu)型基本一致。標(biāo)題化合物的單胞堆積結(jié)構(gòu)中含有4個(gè)[Mn(EDTB)](NO3)2·DMF結(jié)構(gòu)單元。陰離子與其鄰近的配陽離子的苯并咪唑環(huán)上未與Mn(Ⅱ)配位的亞胺基氮形成氫鍵，與鄰近的配陽離子EDTB的苯環(huán)上碳原子形成氫鍵。溶劑DMF分子也與其鄰近的配陽離子EDTB的亞胺基相連的碳原子形成弱氫鍵。晶胞中的8個(gè)陰離子NO3-雖未參與配位，但參與了氫鍵的形成，同時(shí)起電荷平衡的作用。配合物具體氫鍵數(shù)據(jù)如表3所示，據(jù)此可知，整個(gè)晶體中除了范德華引力外，結(jié)構(gòu)單元內(nèi)部、結(jié)構(gòu)單元之間還靠氫鍵來維系，分子間以較緊密的堆積方式彼此作用成一個(gè)整體。

2.2 配合物的PPO活性研究

在 30 ℃，0.1 mol·L-1的 Tris-HCl(pH=8.2)緩沖液中加入固定量的鄰苯三酚溶液，先測定鄰苯三酚自氧化速度，然后加入一定量的PPO模型配合物，測定鄰苯三酚的自氧化速度。加入鄰苯三酚1 min后開始記錄，并每隔30 s分別記錄體系在320 nm處的吸光度。

配合物-鄰苯三酚反應(yīng)體系中，自氧化時(shí)間t對吸光度A的線性回歸方程：

A為吸光度，t為自氧化時(shí)間，K0直線斜率，即鄰苯三酚的自氧化速度，Kt為直線的截距。K0和Kauto分別代表體系中有或無PPO模型化合物時(shí)鄰苯三酚的自氧化速率。鄰苯三酚促進(jìn)率為η，若改變加入PPO的濃度(c)，可計(jì)算出不同濃度時(shí)的促進(jìn)率，作出η-c曲線，再計(jì)算PC50(促進(jìn)率為50%的濃度)。PC50越小，表明該P(yáng)PO模型配合物活性越高[13]。反應(yīng)體系的吸光度A對自氧化時(shí)間t的關(guān)系如圖2，R2代表直線的擬合優(yōu)度值。反應(yīng)體系的回歸參數(shù)及相應(yīng)的促進(jìn)率η見表4。從表4可以看出，在30℃，pH=8.2，配合物濃度在 0.1～10 μmol·L-1范圍內(nèi)，隨著濃度的逐漸增大，配合物催化鄰苯三酚的活性逐漸增大，促進(jìn)率從51.5%增至72%。當(dāng)濃度大于2 μmol·L-1時(shí)，促進(jìn)率逐漸趨于穩(wěn)定。經(jīng)計(jì)算，可得該配合物 PC50約為 0.6 μmol·L-1。

圖2 Tris-HCl(pH=8.2)緩沖體系中吸光度隨時(shí)間和配合物濃度變化關(guān)系Fig.2 Absorbance vs autoxidation time of pyrogallol in Tris-HCl(pH=8.2)buffer at a different concentration of the complex

表4 配合物動(dòng)力學(xué)參數(shù)及促進(jìn)率ηTable 4 Kinetic data and η of the complex

在 30 ℃，底物鄰苯三酚濃度為 4.0 mmol·L-1，模型配合物濃度為 6 μmol·L-1。采用 Tris-HCl，不同pH值的緩沖溶液中，配合物對鄰苯三酚的催化氧化用動(dòng)力學(xué)公式表述，配合物ln[(Af-Ai)/(Af-At)]～t關(guān)系圖見圖3，Af為反應(yīng)完全時(shí)溶液的最終吸光度值，Ai為反應(yīng)開始時(shí)溶液的吸光度值，At為反應(yīng)中某時(shí)刻溶液的吸光度值。ln[(Af-Ai)/(Af-At)]～t關(guān)系圖為直線關(guān)系，斜率為K說明此配合物的多酚氧化酶活性在上述條件下基本符合動(dòng)力學(xué)一級(jí)反應(yīng)。在pH=7.8～8.2 條件下，配合物的轉(zhuǎn)化率 K 由 22.93 h-1增加到51.01 h-1(見表5)，說明配合物的PPO活性隨著pH值的升高而明顯增強(qiáng)。綜上可見，標(biāo)題配合物的PPO模擬活性較高，而其模擬活性機(jī)理還有待進(jìn)一步探討。

圖3 pH對PPO活性的影響Fig.3 Effect of pH on PPO activity

表5 pH條件對配合物的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)的作用Table 5 Effect of pH on kinetic data of the complex

致謝：感謝華中師范大學(xué)化學(xué)院劉長林教授悉心的指導(dǎo)和修改!

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Synthesis and Crystal Structure of Complex[Mn(EDTB)](NO3)2·DMF and Its Polyphenol Oxidase Activity

WANG Li＊,1WEI Li-Mei1ZHANG Yong1,2PEI Ya-Mei1
(1School of Chemistry,Central China Normal University,Wuhan 430079,China)(2School of Chemical and Materials Engineering,Huangshi Institute of Technology,Huangshi,Hubei 435003,China)

The title complex[Mn(EDTB)](NO3)2·DMF[EDTB=N,N,N′,N′-tetrakis-[(2-benzimidazolyl)methyl]-1,2-ethanediamine]has been synthesized and characterized by elemental analysis and single crystal X-ray diffraction method.The crystal of mononuclear Mn(Ⅱ) complex belongs to orthorhombic crystal system with space group,P212121,a=1.172 52(6)nm,b=1.320 83(6)nm,c=2.461 91(12)nm,V=3.812 8(3)nm3,Dc=1.451 Mg·m-3,Z=4,F(000)=1 732.The final R(I＞2σ(I)):R1=0.052 2,wR2=0.102 2 and R(all data):R1=0.065 2,wR2=0.107 5,Flack parameter:0.02(15).The manganese(Ⅱ) atom of the cation has distorted octahedral coordination geometry and is six-coordinated by four nitrogen atoms of the benzimidazole groups and two tertiary amine nitrogen atoms from the ligand.Polyphenol oxidase activity toward pyrogallol has been studied spectroscop ically.In the 0.1 ～10 μmol·L-1rang,promotion rates of the complex increase from 51.5%to 82.2% .The turnover numbers of the complex toward pyrogallol increase from 22.93 h-1to 51.01 h-1at 30 ℃,showing polyphenol oxidase activity of the complex increasing with pH.CCDC:771022.

manganese(Ⅱ)complex;EDTB;crystal structure;polyphenol oxidase activity

O614.7+11

：A

：1001-4861(2011)01-0125-06

2010-06-27。收修改稿日期：2010-10-12。

國家自然科學(xué)基金(No.21001047)和深圳微生物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金資助項(xiàng)目。

＊通訊聯(lián)系人。E-mail：wl_928@mail.ccnu.edu.cn；會(huì)員登記號(hào)：S060015331M。