毛 捷，徐善水，江曉春，陳建民，劉景平

(1.皖南醫(yī)學院附屬弋磯山醫(yī)院 神經(jīng)外科，安徽 蕪湖 241001;2.中南大學湘雅醫(yī)院 神經(jīng)外科，湖南 長沙 410300)

顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是神經(jīng)外科常見病，我國每年TBI的發(fā)病率為100～150人/10萬人，占創(chuàng)傷病人總數(shù)的15%左右，病死率為創(chuàng)傷病人總數(shù)的85%［1］。損傷后的繼發(fā)性損害是致殘或死亡的重要原因，其發(fā)生機制尚不能完全闡明，目前研究認為，繼發(fā)性損傷的發(fā)生與損傷后中樞神經(jīng)系統(tǒng)生化物質(zhì)的含量變化關系密切，有關顱腦損傷的研究很多，動物模型的制作也日趨完善［2］。本研究仿照經(jīng)典的自由落體硬膜外撞擊方法制作腦損傷模型，通過傷側(cè)腦含水量測定和病理學改變觀察模型復制是否成功，利用微透析技術收集損傷前后細胞外液(ECF)，探討微透析技術在腦損傷后局部生化物質(zhì)監(jiān)測中的運用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 微透析裝置購自美國Bioanalytical Systems公司，探針選擇BR型，透析膜長4.0 mm，外直徑0.5 mm，立體定向儀為西安西北光電儀器廠產(chǎn)品，動物呼吸機為浙江大學醫(yī)學儀器廠生產(chǎn)，谷氨酸為美國BDH公司生產(chǎn)。

1.2 實驗動物分組 健康雄性SD大鼠15只，中南大學湘雅醫(yī)學院實驗動物學部提供，清潔級，體重220～275 g，隨機分為對照組及損傷組，損傷組包括輕傷組和重傷組，每組5只。

1.3 腦損傷動物模型制備 采用經(jīng)典Feeney's自由落體硬膜外撞擊方法［2］，10%水合氯醛(0.35/kg)腹腔內(nèi)麻醉，氣管切開，頭部固定于立體定向儀，中線旁、人之縫前各2 mm右額骨磨成直徑5 mm骨窗，保持硬膜完整。輕度和重度損傷的致傷力分別為200 g/cm和1 000 g/cm，撞擊致傷后，呼吸機輔助呼吸，頻率為85 次/min，吸∶呼 =1∶2，潮氣量為6 ml，損傷前后15 min各取股動脈血行血氣分析。對照組切開頭皮和開骨窗，實驗中保持肛溫在(37.0±0.5)℃。

1.4 ECF的收集 灌注液選用Ringe's液，速度為2 μl/min。顯微鏡下切開硬腦膜，立體定向儀引導透析管置入腦內(nèi)，深度4 mm。灌注1 h取得穩(wěn)定的基礎值，間隔15 min收集1次，傷前標本的平均值作為傷前基礎值。傷后繼續(xù)灌注2 h，-70℃保存待測。

1.5 Glu含量的測定 OPA柱前衍生HPLC熒光法檢測，參照 Bianchi［3］的方法建立。ANASTAR 色譜工作站記錄分析，峰面積外標法定量。

1.6 傷側(cè)腦組織含水量的測定 斷頭取腦，去除小腦、腦干和嗅腦，取傷側(cè)大腦半球，去除表面血液，分析天平稱量濕重，置入110℃恒溫烤箱24 h干燥至恒重，按Elliot公式計算腦含水量。

1.7 組織病理學檢測 標本收集完成后，斷頭取腦，肉眼觀察損傷差異，距損傷邊緣0.5 cm各處取腦組織1塊，常規(guī)固定切片，石蠟包埋，HE染色，光鏡觀察。

1.8 統(tǒng)計學分析 均采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料全部用均數(shù)±標準差(±s)表示，計量資料的比較采用t檢驗，各組之間的比較采用方差分析，以α=0.05為檢驗水準(雙側(cè))，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 動脈血氣分析 各組傷前和傷后動脈血氣分析結(jié)果見表1。血氣指標均在正常生理范圍，無低氧及二氧化碳蓄積，傷前、后pH值、PaCO2及PaO2值差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表1 各組傷前、傷后的血氣分析結(jié)果(mmHg，±s，n=15)Tab 1 The numerical value of blood gas analysis after traumatic brain injury(mmHg，±s，n=15)

表1 各組傷前、傷后的血氣分析結(jié)果(mmHg，±s，n=15)Tab 1 The numerical value of blood gas analysis after traumatic brain injury(mmHg，±s，n=15)

對照組 輕度組 重度組pH PaO2 PaCO2 pH PaO2 PaCO2 pH PaO2 PaCO2 4±5.4 38.1±1.1 7.40±0.4 132.6±8.9 38.7±1.7傷后 7.41±0.05 132.8±6.3 39.2±2.1 7.40±0.07 131.2±7.8 37.7±1.2 7.41±0.3 130.9±9.3 39.1±2.2配對 t值 1.336 0.925 1.257 0.748 1.272 1.423 1.236 1.076 1.351 P值 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.0傷前 7.40±0.02 132.7±7.7 39.2±2.2 7.40±0.02 131.5 ＞0.05

2.2 Glu含量的變化 對照組Glu基礎水平為(2.17±0.23)μmol/L，各時間段變化很小，數(shù)值無明顯變化(P＞0.05)。損傷組基礎水平與對照組基本相同(P＞0.05)，損傷后兩組Glu含量迅速升高，30 min達峰值，分別為(14.54±1.66)和(20.83±1.97)μmol/L，二者差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其后逐漸下降。90 min后接近對照組。重傷組在15～75 min內(nèi)高于對照組(P﹤0.05)，輕傷組在15～75 min內(nèi)顯著高于對照組，但低于重傷組(P﹤0.05，圖1)。

圖1 ECF中Glu水平的變化(μmol/L，±s，n=15)Fig 1 The dynamic varieties of glutamate concentration after traumatic brain injury(μmol/L，±s，n=15)

2.3 傷側(cè)腦組織含水量 對照組腦組織含水量為(77.07±0.16)%，損傷組傷側(cè)腦組織含水量與其相比均增高，如表2，各組之間比較，差異具有統(tǒng)計學意義﹙P＜0.05﹚。

表2 傷后2 h腦組織含水量(%，±s，n=15)Tab 2 Water content in the lateral brain within 2 hour of traumatic brain injury(%，±s，n=15)

表2 傷后2 h腦組織含水量(%，±s，n=15)Tab 2 Water content in the lateral brain within 2 hour of traumatic brain injury(%，±s，n=15)

注:與對照組比較，﹡P＜0.05;傷組比較，﹟P＜0.05

組別 腦組織含水量對照組0.000 77.07±0.16輕傷組 78.90±0.24﹡重傷組 81.55±0.57﹡﹟F 值 186.5 P值

2.4 肉眼觀察損傷程度 如圖2所示，輕傷組可見腦皮層損傷，蛛網(wǎng)膜下腔出血，重傷組見局部明顯挫裂傷灶，兩者比較可見明顯差異。

2.5 組織病理學觀察 對照組腦皮質(zhì)錐體細胞分布密集，結(jié)構(gòu)良好;輕傷組皮質(zhì)錐體細胞數(shù)量減少，組織疏松，出現(xiàn)呈固縮濃染的錐體細胞;重傷組皮質(zhì)錐體細胞分布稀疏，結(jié)構(gòu)紊亂，部分胞核偏位，可見大量空泡區(qū)(見圖3)。

圖2 肉眼下大鼠腦損傷程度Fig 2 Gross view of brain injury level

圖3 大鼠大腦皮層HE染色(×400)Fig 3 The patho-chng of cerebral cortex by hematoxylin-eosin staining(×400)

3 討論

3.1 腦損傷模型的制作合理性 顱腦損傷是神經(jīng)外科常見病，致殘率和病死率高，如何有效地防治創(chuàng)傷引起的繼發(fā)性損傷是改善病人預后的關鍵。有關腦損傷的研究很多，動物模型的制作也日趨完善。目前研究認為雌激素對各種因素造成的神經(jīng)細胞的損害具有保護作用，主要通過作用于各種雌激素受體，調(diào)控細胞凋亡途徑中的保護性基因，同時作用于神經(jīng)膠質(zhì)細胞使其表達各種細胞因子而起到保護作用［8，9］。本研究選擇SD雄性大鼠，受雌激素周期變化影響小，可以排除雌激素水平對實驗結(jié)果的影響。仿照經(jīng)典自由落體撞擊硬腦膜造成損傷模型，具有操作簡單、影響因素單純的優(yōu)點。從圖2可見，肉眼下直觀地顯示不同的沖擊力造成的大鼠皮質(zhì)局部損傷差異很明顯。表2顯示隨著損傷程度增加腦組織含水量明顯增加，兩組差異比較具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);病理學檢測結(jié)果和對照組比較，輕傷組皮質(zhì)錐體細胞大部分形態(tài)正常，可見少量細胞濃染，但結(jié)構(gòu)尚存;重傷組皮質(zhì)錐體細胞損害加重，可見大量空泡區(qū)，部分神經(jīng)細胞缺失。肉眼觀察損傷面積的大小及程度，腦組織水含量測定和組織病理改變均證實本模型造成局灶性腦損傷復制成功，實驗操作過程中體會該模型簡易可靠，成功率高。

3.2 微透析技術在腦損傷模型的應用 腦損傷的生化研究是神經(jīng)科學研究中的一個重要方面，以往多采用分析腦勻漿、腦脊液中的生化物質(zhì)含量進行研究，這些方法不能動態(tài)反映活體ECF中生化物質(zhì)的變化。ECF是神經(jīng)細胞直接生存的內(nèi)環(huán)境，細胞功能和代謝的變化常引起ECF中生化物質(zhì)的改變，檢測ECF的生化物質(zhì)含量對研究腦的病理生理有重要作用。微透析技術可以持續(xù)進行ECF動態(tài)采樣，適用于腦的生理病理研究［4］。微透析管由多碳聚合物半透膜組成，具有選擇性物質(zhì)雙向交換作用，擴散方向取決于管內(nèi)外該物質(zhì)的相對濃度。由于透析管中的灌流液不斷流動更新，導致跨膜濃度梯度始終存在，微透析持續(xù)進行。收集灌流液，測定其中的待測物質(zhì)含量，就可監(jiān)測該物質(zhì)的含量變化。因此，微透析技術可持續(xù)檢測腦損傷前后損傷局部ECF中生化物質(zhì)水平，透析液內(nèi)不含酶等大分子物質(zhì)，不僅可防止樣品中的化學物質(zhì)被酶降解，且無需去蛋白等常規(guī)的前處理工作，直接注入分析儀器進行檢測［5，6］。

微透析技術是有創(chuàng)檢測方法，Landolt H等［7］計算膜長4 mm、直徑0.5 mm的透析管插入的損傷范圍只有0.75～1.5 mm3大小。本研究選擇Ringe's液為灌注液，采用低速率灌注，觀察到微透析管插入腦組織前后對局部ECF中Glu含量影響很小(見圖1)，表明了微透析方法本身對腦組織的干擾很小，其差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。本研究模型微透析管的插入在顱骨開窗后直視下進行，可避開血管，收集端可置于腦的指定部位，檢測的生化物質(zhì)含量反映了損傷部位的變化，排除了非損傷區(qū)影響?？梢酝茢嘣谀X損傷局部生化物質(zhì)的動態(tài)研究中，微透析技術是一種較理想的方法。

繼發(fā)性損傷的形成機制，目前還不完全清楚。目前的研究認為ECF中興奮性氨基酸(EAA)增多可反映細胞缺血或損傷的程度［10］。EAA可充當反映腦損傷預后的生化標志［11］。本研究觀察到損傷組Glu基礎水平與對照組基本相同，傷后迅速升高，30 min內(nèi)達峰值，兩組分別是基礎水平的6.7和9.6倍，兩者比較具有統(tǒng)計學意義﹙P＜0.05，如圖1﹚，進一步證實本損傷模型輕傷組和重傷組之間的差異具有統(tǒng)計學意義。

綜上所述，利用微透析技術動態(tài)監(jiān)測ECF中生化物質(zhì)的變化為腦神經(jīng)保護的研究提供了新的方法，而動物模型的合理制作是研究的前提，本研究成功制作大鼠腦損傷的動物模型及微透析技術的采用，為隨后的研究打下了實驗基礎。

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