王恩旺，楊小龍，鄧小樂

(1.馬鞍山市人民醫(yī)院 心胸外科，安徽 馬鞍山 243000;2.皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院 心胸外科，安徽 蕪湖 241001)

p300/CBP為組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶，是同源轉(zhuǎn)錄輔助激活因子，具有內(nèi)在乙酰轉(zhuǎn)移酶活性。Smad4為抑癌基因，是目前發(fā)現(xiàn)的惟一一種CO-Smads，其蛋白產(chǎn)物是TGF-β超家族受體的直接底物。p300/CBP可通過與Smads結(jié)合增強TGF-β誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性。本實驗采用免疫組織化學(xué)的方法(SABC法)，測定肺癌和正常肺組織中p300/CBP、Smad4蛋白的表達，觀察其結(jié)果與肺癌臨床病理的關(guān)系，并分析它們之間的相關(guān)性，旨在探討 p300/CBP、Smad4在NSCLC發(fā)病機制中的作用，同時為p300/CBP、Smad4用于NSCLC的抗腫瘤治療提供一定的實驗和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選用2008年1月～2009年1月皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院術(shù)前未經(jīng)放療和化療的原發(fā)性肺癌手術(shù)標(biāo)本(石蠟包埋)60例。取上述標(biāo)本中距離腫瘤邊緣6 cm以上的正常肺組織20例、并經(jīng)病理檢查排除腫瘤累及。標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片，進行免疫組織化學(xué)染色，其中一片行HE常規(guī)染色用于病理診斷。組織病理分型、分級由病理科診斷。60例NSCLC中男性43例，女性17例?！?5歲33例，＜55歲27例。病理分型:肺鱗癌38例，肺腺癌22例。中心型肺癌28例，周圍型肺癌32例。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例。按1997年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)新修訂的肺癌TNM分期:ⅠA期3例、ⅠB期14例、ⅡA期12例、ⅡB期17例、ⅢA期14例，無ⅢB、Ⅳ期病例。腫瘤直徑＞3 cm 29例，≤3 cm 31例。分化程度:高分化+中分化為39例，低分化21例。

1.2 主要試劑 Smad4濃縮型兔多克隆抗體(武漢博士德)，p300/CBP濃縮型鼠抗人單克隆抗體(NeoMarker)，SABC免疫組化試劑盒和3-3'二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(武漢博士德)。

1.3 方法 免疫組織化學(xué)SABC法60例肺鱗癌和肺腺癌均行 Smad4(1∶50)、p300/CBP(1∶100)免疫組織化學(xué)染色。染色方法按說明書進行。以磷酸緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照，Smad4、p300/CBP陽性切片作為陽性對照。

1.4 結(jié)果判定

1.4.1 Smad4蛋白定位于肺泡上皮細胞漿(胞核)或癌細胞漿(胞核)內(nèi)，細胞內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色細小顆粒者為陽性染色。根據(jù)染色陽性的細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比分為:陽性細胞＜20%為陰性，陽性細胞≥20%為陽性表達。

1.4.2 p300/CBP蛋白定位于癌細胞核內(nèi)和支氣管黏膜上皮細胞核內(nèi)，部分呈核-漿型，細胞核被染成棕黃色為p300/CBP陽性表達。每張切片在400倍鏡下觀察5個視野，每個視野計數(shù)100個腫瘤細胞，共計500個細胞，無p300/CBP陽性表達者計0分，陽性細胞數(shù)≤10%為1分，11% ～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。再按染色強度評分:無色為0，淡色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。最后將陽性細胞所占計數(shù)細胞百分比的染色分級與強度分級兩項指標(biāo)評分相乘，得出染色等級評分:“-”(0～2)，“+”(3～4)，“?”(6～8)，“?”(9～12)?！?”為陰性表達，“+”、“?”及“?”為陽性表達，其中“?”和“?”為過度表達［1］。

1.4.3 正常肺組織分級參照上述標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。采用χ2檢驗分析各組計數(shù)資料;NSCLC中p300/CBP表達與腫瘤各臨床病理特征之間的分析，不同分組之間采用秩和檢驗(Mann-Whitney U，或 Kruskal-Wallis Test);正常肺組織中及NSCLC中p300/CBP、Smad4的表達、相互之間的關(guān)系及雙向有序資料采用Spearman等級相關(guān)分析。P＜0.05視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

p300/CBP在正常肺組織中呈中-低表達，陽性表達率為35.0%(7/20)，未發(fā)現(xiàn)有過表達(0/20)，在NSCLC組織中陽性表達率為65.0%(39/60)，過表達率為51.7%(39/60)，主要表達于細胞核(見圖1～6)。

Smad4在正常肺組織中呈高表達，陽性表達率為90.0%(18/20)，在NSCLC組織中逐漸降低呈中-高度表達，陽性表達率為63.3%(38/60)，主要表達于細胞質(zhì)或細胞核中(見圖1～6)。

p300/CBP和Smad4均與NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期等臨床病理學(xué)參數(shù)有關(guān)(P＜0.05)，在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，均隨著腫瘤分期的增高而降低(見表1、2)。

p300/CBP的表達還與NSCLC分化有關(guān)，在中、高分化肺癌細胞的表達明顯高于在低分化肺癌細胞中的表達(P ＜0.05)，呈輕度負相關(guān) (rs=-0.287，P=0.026)，見表1。

p300/CBP、Smad4在NSCLC組織中陽性表達率呈中度負相關(guān)(rs=-0.413，P=0.001)，見表3。

表1 p300/CBP在NSCLC臨床病理特征不同組之間的表達Tab 1 p300/CBP expression by classification of clinicopathologic features in NSCLC

表2 Smad4在NSCLC臨床病理特征不同組之間的相關(guān)性Tab 2 Correlation of Smad4 expression by classification of the clinicopathologic features in NSCLC

表3 p300/CBP、Smad4在NSCLC表達關(guān)系Tab 3 Relationship between expression of Smad4 and p300/CBP in NSCLC

4 討論

p300/CBP是同源轉(zhuǎn)錄輔助激活因子，分別位于22p13和16p13.3，具有內(nèi)在的乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，催化可逆的組蛋白乙?；300/CBP本身亦可減緩由染色質(zhì)本身結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的啟動子抑制作用和恢復(fù)靶基因啟動子基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄器效應(yīng)［2］。

p300/CBP作為原癌蛋白，可抑制腫瘤，但可有異常活化，為誘導(dǎo)腫瘤的癌蛋白。p300/CBP是細胞周期負調(diào)節(jié)基因。p300/CBP通過活化AP-1，調(diào)控cyclin D1基因表達。E2F家族過度表達與肺癌密切相關(guān)，并且隨腫瘤分期升高而增高。E2F可在p300/CBP賴氨酸殘基上被乙?；诜肿铀缴螩DK介導(dǎo)p300/CBP和E2F-1相互作用、促進細胞進入不可逆的過程［3］。p21WAF/CIP1可上調(diào)p300/CBP活性表達，從而抑制細胞周期運行。DNA的復(fù)制和修復(fù)同樣需要p300/CBP的參與。p53突變是不同類型肺癌中最常見的基因改變，且出現(xiàn)的頻率比其他腫瘤高。突變型p53不僅失去了正常的抑癌作用，而且還促進惡性轉(zhuǎn)化。p300/CBP的CH1區(qū)域?qū)53有泛素連接酶活性，p300/CBP通過Mdm2依賴或非依賴機制調(diào)節(jié)p53泛蛋白化作用和降解，有助于控制 p53 穩(wěn)定性［4］。p53 可被包含 p53、Mdm2 和p300/CBP的三元絡(luò)合物降解。在p53信號通路中，p300/CBP還通過乙?；筂dm2失活，引發(fā)細胞凋亡［5］。本研究的實驗結(jié)果顯示，p300/CBP在NSCLC的性別、年齡、腫瘤部位、病理類型各不同組之間的表達，P＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。p300/CBP在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中陽性表達明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織(P＜0.05)，呈輕度負相關(guān) (rs=-0.372，P=0.003)。p300/CBP 的表達隨著腫瘤級別的增高而降低，在中、高分化肺癌細胞中的陽性表達明顯高于在低分化肺癌細胞中的表達(P＜0.05)，呈輕度負相關(guān) (rs=-0.287，P=0.026)。p300/CBP的表達亦隨著腫瘤分期的增高而降低，三組之間的表達有明顯差異 (P＜0.05)，并呈中度負相關(guān) (rs=-0.573，P=0.001)。CBP 在早期上皮細胞癌中過度表達已被證實，CBP的過度表達、或優(yōu)先使用是通過特定活躍的轉(zhuǎn)錄因子，或兩者聯(lián)合體，并且在肺癌中不抑制細胞增殖和死亡［6］。Smad4系位于l8q21.1上的抑癌基因，其蛋白產(chǎn)物是TGF-β超家族受體的直接底物。TGF-β家族是為數(shù)不多的內(nèi)源性細胞生長調(diào)節(jié)蛋白，主要調(diào)控細胞增殖、分化、遷移、免疫反應(yīng)、血管生成、凋亡及細胞外基質(zhì)的沉積。TGF-β信號通路失調(diào)能夠促進腫瘤發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移的進程，恢復(fù)TGF-β信號通路則可減少人類腫瘤(如肺癌)的發(fā)生［7］。TGF-β需Smads將刺激所產(chǎn)生的信息從細胞內(nèi)傳遞至細胞核。Smad4蛋白是目前發(fā)現(xiàn)的惟一一種CO-Smads，因為其可以和其他Smad蛋白形成復(fù)合體，有效地傳遞任務(wù)而居關(guān)鍵性地位，目前對其調(diào)控TGF-β誘導(dǎo)的基因表達研究較多:Ke Z等［8］應(yīng)用免疫組化等方法分析肺癌組織中各種不同血管生成因子表達以及瘤內(nèi)微血管密度，結(jié)果顯示Smad4表達缺失和瘤內(nèi)微血管密度具有顯著的相關(guān)性，提示Smad4作為調(diào)節(jié)因子在肺癌的血管發(fā)生中起著重要的作用。Smad4基因發(fā)生突變，將伴隨著癌癥的發(fā)生。若調(diào)節(jié)Smad4蛋白在細胞中的功能，可以進一步抑制癌癥的生成［9，10］。本研究的實驗結(jié)果顯示，正常肺組織Smad4陽性表達率為90.0%，肺癌組織中Smad4蛋白的表達率為63.3%，低于正常組織(P＜0.05)。Smad4在NSCLC的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小和病理類型和分化程度各不同組之間的表達，P＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Smad4在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中陽性表達明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織(P＜0.05)，呈輕度正相關(guān)(rs=0.295，P=0.022)。Smad4陽性表達率隨著腫瘤分期的增高而降低 (P＜0.05)，呈中度正相關(guān)(rs=0.487，P=0.000)。提示Smad4表達與肺癌發(fā)生發(fā)展、生物學(xué)行為及其預(yù)后有密切關(guān)系，其作用機制與Smad4本身的生物學(xué)作用有關(guān)。

p300/CBP可通過與Smads結(jié)合增強TGF-β誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性。p300/CBP在Smad4的存在下，增強TGF-β及 Smads誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性。p300/CBP、Smad4的有機結(jié)合，以及協(xié)同激活子的參與，能使TGF-β 誘導(dǎo)的基因表達增強［11］。p300/CBP、Smads蛋白的低表達可使TGF-β的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的中斷，從而使上皮細胞逃脫了TGF-β對其生長抑制作用。Smads、p300/CBP可作為整體與不同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，但其他轉(zhuǎn)錄因子也可和Smads競爭性地與p300/CBP結(jié)合、或直接干擾Smads而妨礙Smads介道的轉(zhuǎn)錄。本研究的實驗結(jié)果顯示:正常肺組織中p300/CBP與 Smad4的表達無相關(guān)(rs=-0.105，P=0.660)，NSCLC組織中 p300/CBP與Smad4的表達呈中度負相關(guān)(rs=-0.413，P=0.001)，且均與NSCLC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和 TNM分期相關(guān)，提示在NSCLC的一系列病程發(fā)展過程中，高表達的p300/CBP與Smad4的協(xié)同作用可能是NSCLC腫瘤細胞永生化的重要因素。故聯(lián)合檢測p300/CBP和Smad4的表達，在預(yù)測NSCLC的惡性生物學(xué)行為方面可能比單因素檢測更具有意義，預(yù)計聯(lián)合使用分別針對 p300/CBP及 Smad4靶向藥物，有望提高NSCLC治療的有效率。

總之，肺癌的發(fā)生是多因素、多步驟的過程，可同時有原癌基因激活和抑癌基因滅活。隨著對p300/CBP結(jié)構(gòu)和功能等相關(guān)研究的不斷深入，將有助于在人類細胞中具有抗癌藥物一樣功能的p300/CBP抑制劑的問世，為腫瘤的防治工作帶來新的契機。

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