吳明彩，蔣 明，李大彩，畢富勇

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002;2.第二炮兵蕪湖鳩江干休所 衛(wèi)生所，安徽 蕪湖 241000)

DNA甲基化被認(rèn)為是腫瘤形成的重要機(jī)制之一，抑癌基因可因高度甲基化而失活，這種基因沉默調(diào)控與體細(xì)胞突變共同促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展［1］。人類RUNX3(runt-related transcription factor 3)是一種新型的抑癌基因，位于1號(hào)染色體的1p36.1［2］，已在人類多種實(shí)體瘤中發(fā)現(xiàn)存在RUNX3啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化，而急性白血病中該基因的甲基化狀態(tài)的研究尚處于探索階段。本實(shí)驗(yàn)選用白血病Reh細(xì)胞株為研究對(duì)象，進(jìn)行體外培養(yǎng)，采用MTT、MSP以及RT-PCR方法檢測(cè)5-氮-2'脫氧胞苷對(duì)Reh細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、RUNX3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)及表達(dá)的影響，探討去甲基化制劑對(duì)Reh細(xì)胞增殖及其RUNX3基因表達(dá)的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與藥品 RPMI 1640培養(yǎng)基(上海生工);胎牛血清(BIO CHROM);DNA提取試劑盒(Promega公司);DNA甲基化試劑盒(Qiagen公司);Trizol試劑(上海生工);PCR試劑盒(Promega公司);RT-PCR(Promega公司);DNA Marker(上海生工);瓊脂糖(西班牙進(jìn)口);DNaseⅠ(上海生工)。引物由上海生工公司合成。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人白血病細(xì)胞系Reh購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)(ATCC建系)。Reh細(xì)胞于 RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，37℃、5%CO2、飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中孵育，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。將細(xì)胞以適宜密度接種，加入含5-氮-2'脫氧胞苷的RPMI 1640培養(yǎng)基，使其藥物最終濃度分別為0.5、2.5、12.5 μmol/L，每 24 h 更換新鮮藥液，藥物濃度同前，連續(xù)作用3 d后棄去藥液，以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)5 d，以未加藥物的細(xì)胞株作為對(duì)照組。

1.2 方法

1.2.1 MTT試驗(yàn)(四唑鹽比色分析法) 上述經(jīng)不同濃度藥物處理3 d后的Reh細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞，以每孔1×104接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積100 μl，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，分別于第 24 h、48 h、72 h，于96 孔板中每孔加入 MTT(5 mg/ml，Sigma)20 μl孵育4 h。離心(1 000 rpm，5 min)，棄上清。每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，振蕩 10 min，酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)吸光度A值。按下列公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率:細(xì)胞增殖抑制率%=(1－實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.2.2 MSP檢測(cè)RUNX3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化取上述經(jīng)不同濃度藥物處理3 d后的Reh細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞1×106，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，按DNA提取說(shuō)明書(Promega公司)提取各組細(xì)胞基因組DNA，對(duì)提取的DNA用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度及含量，DNA 純度測(cè)定:A260/A280＞1.8。取2 μg DNA 按DNA甲基化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行修飾及純化，純化后的DNA立即使用或－20℃保存?zhèn)溆?。純化后的DNA作為模板進(jìn)行MSP，甲基化特異性引物上游序列為 5'-TTACGAGGGGCGGTCGTACGCGGG-3'，下游引物為 5'-AAAACGACCGACGCGAACGCCTCC-3'，擴(kuò)增片段為210 bp。非甲基化特異性引物上游序列為5'-TTATGAGGGGTGGTTGTATGTGGG-3'，下游引物為 5'-AAAACAACCAACACAAACAACTCC-3'，擴(kuò)增片段為210 bp。PCR反應(yīng)體系(25 μl):2×GoTaq?Hot Start Green Master Mix 12.5 μl，修飾后的 DNA模板 2 μl，雙蒸水 8.5 μl，引物(10 μmol/L)各 1 μl。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min后進(jìn)行35個(gè)循環(huán):94℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，最后一個(gè)循環(huán)后再72℃延伸5 min。每個(gè)樣本擴(kuò)增時(shí)，同時(shí)以滅菌雙蒸水作為陰性對(duì)照。取5 μl PCR產(chǎn)物2%的瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠)電泳，分析產(chǎn)物。結(jié)果判斷:僅出現(xiàn)甲基化條帶為高甲基化，僅出現(xiàn)非甲基化條帶為未甲基化，同時(shí)出現(xiàn)為半甲基化。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè) RUNX3 mRNA的表達(dá) 取1×106細(xì)胞用Trizol試劑提取各組RNA，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。用DNaseⅠ(RNA free)消化RNA中痕量的DNA，用紫外分光光度計(jì)及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的含量及純度。RNA的純度測(cè)定:A260/A280＞2.0。取消化后的RNA作為模板進(jìn)行RT-PCR試驗(yàn)，操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。RT-PCR體系為25 μl，2 × AccessQuickTMMaster Mix 12.5 μl，RNA 模板 2 μl，Nuclease-free water 6.5 μl，引物各 2 μl，AMV Reverse Transcriptase 0.5 μl。以 β-actin 作為內(nèi)參照。RUNX3及β-actin內(nèi)參照的引物序列如下:RUNX3上游序列為5'-TGGCAGGCAATGACG-3'，下游序列為 5'CAGGGAACGGCTTGGT-3'，產(chǎn)物為258 bp;β-actin上游序列為5'-CGCGAGAAGATACCCAGAT-3'，下游序列為5'-GCACTGTGTTGGCGTACAGG-3'，產(chǎn)物為550 bp。RT-PCR反應(yīng)條件為:45℃孵育45 min，95℃預(yù)變性2 min之后進(jìn)行35個(gè)如下循環(huán):95℃變性30 s，52℃(RUNX3)60℃(β-actin)退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，最后一個(gè)循環(huán)后再72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物2%的瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠)電泳，分析擴(kuò)增產(chǎn)物。采用凝膠分析系統(tǒng)(捷達(dá)801系列)分析，以RUNX3/β-actin吸光度比值表示RUNX3 mRNA的相對(duì)水平。

1.2.4 SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理與數(shù)據(jù)分析數(shù)值變量資料以±s表示，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn);多組之間采用單因素方差分析(F檢驗(yàn))或秩和檢驗(yàn)，P＜0.05作為判斷差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的依據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 5-氮-2'脫氧胞苷對(duì) Reh細(xì)胞增殖的影響MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)(表1)，Reh細(xì)胞經(jīng)3種不同濃度的5-氮-2'脫氧胞苷處理后，各組的細(xì)胞增殖抑制率如圖1所示?？梢?jiàn)，同一時(shí)間不同藥物濃度之間的細(xì)胞增殖抑制率隨濃度增大其抑制率增大，同一藥物濃度不同時(shí)間組的細(xì)胞增殖抑制率隨時(shí)間延長(zhǎng)其抑制率也增大，兩者均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，5-氮-2'脫氧胞苷對(duì)Reh細(xì)胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)時(shí)間和劑量的依賴性。

2.2 5-氮-2'脫氧胞苷處理前后RUNX3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)改變 MSP檢測(cè)Reh細(xì)胞用藥前后RUNX3基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)，見(jiàn)圖2。經(jīng)0.5、2.5、12.5 μmol/L 不同濃度 5-氮-2'脫氧胞苷處理72 h后，對(duì)照組(未干預(yù)組)甲基化條帶明顯，而未甲基化條帶隱約可見(jiàn);在不同濃度5-氮-2'脫氧胞苷處理組，甲基化和未甲基化條帶均明顯可見(jiàn)，有甲基化和非甲基化共存現(xiàn)象，表明部分被去甲基化了。

表1 不同濃度5-氮-2'脫氧胞苷去甲基化干預(yù)在不同的作用時(shí)間對(duì)Reh細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率(±s，n=3)Tab 1 The inhibitory rate of different concentrations and time on proliferation in Reh cells by demethylation agent 5-aza-2'-deoxycytidine

表1 不同濃度5-氮-2'脫氧胞苷去甲基化干預(yù)在不同的作用時(shí)間對(duì)Reh細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率(±s，n=3)Tab 1 The inhibitory rate of different concentrations and time on proliferation in Reh cells by demethylation agent 5-aza-2'-deoxycytidine

注:*表示同一時(shí)間不同濃度之間兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05;#表示同一濃度不同時(shí)間之間兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05

組別 細(xì)胞抑制率(%)24 h 48 h 72 h F值 P值對(duì)照組000＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 0.5 μmol/L 13.84 ±1.17*# 17.28 ±0.28*# 28.56 ±0.96*# 223.73 ＜0.05 2.5 μmol/L 21.70 ±2.34*# 27.47 ±2.29*# 42.56 ±1.33*# 82.74 ＜0.05 12.5 μmol/L 38.13 ±0.92*# 46.72 ±1.91*# 62.00 ±1.74*# 174.97 ＜0.05 F 值 176.51 224.90 441.68 P值

圖1 不同濃度5-氮-2'脫氧胞苷去甲基化干預(yù)對(duì)Reh細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig 1 The inhibition of cell proliferation by demethylation agent 5-aza-2'-deoxycytidine of different concentrations in Reh cells

圖2 Reh細(xì)胞經(jīng)5-氮-2'脫氧胞苷干預(yù)72 h前后RUNX3基因啟動(dòng)區(qū)甲基化狀態(tài)Fig 2 The methylation status of RUNX3 promoter region in Reh cells treated with 5-aza-2'-deoxycytidine before and after 72 hours

2.3 不同濃度5-氮-2'脫氧胞苷處理前后對(duì)RUNX3 mRNA表達(dá)影響 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，RUNX3 mRNA在對(duì)照組細(xì)胞中不表達(dá)，經(jīng)0.5、2.5、12.5 μmol/L 不同濃度 5-氮-2'脫氧胞苷處理后可見(jiàn)RUNX3 mRNA重新表達(dá)，如圖3所示，且其表達(dá)強(qiáng)度與5-氮-2'脫氧胞苷的濃度呈劑量依賴關(guān)系，相對(duì)表達(dá)量分別為，對(duì)照組:0.000±0.000;0.5μmol/L組:0.216 ±0.012;2.5 μmol/L 組:0.432±0.009;12.5 μmol/L 組:0.587 ± 0.020。各濃度組與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，各濃度組之間比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖3 不同濃度5-氮-2'脫氧胞苷干預(yù)72h前后RUNX3 mRNA的表達(dá)Fig 3 RUNX3 mRNA expression of Reh cells treated with 5-aza-2'-deoxycytidine before and after 72 hours

3 討論

DNA甲基化作為表現(xiàn)遺傳學(xué)的一種調(diào)控機(jī)制是最早被發(fā)現(xiàn)的［3］，它在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育及基因組印記等方面起著重要作用，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［4］。急性白血病的發(fā)生是一個(gè)多步驟、多因素參與的復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，越來(lái)越多的證據(jù)表明基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的高度甲基化也是白血病等血液系統(tǒng)惡性腫瘤的一種發(fā)病機(jī)制，大概有90%的血液系統(tǒng)惡性腫瘤都會(huì)有至少一個(gè)基因高度甲基化［5］。近年來(lái)許多研究表明，DNA甲基化狀態(tài)異常尤其是抑癌基因的高甲基化失表達(dá)在白血病的發(fā)生發(fā)展、診斷、檢測(cè)微小殘留病、預(yù)測(cè)病情及指導(dǎo)治療方面都有重要作用［6～8］。本研究室近年也在白血病基因治療方面做了大量工作［9，10］。

RUNX3基因是Levanon等于1994年發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，研究發(fā)現(xiàn)，RUNX3蛋白可指導(dǎo)TCF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中激活的Smad復(fù)合物從細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)特定靶位點(diǎn)，加強(qiáng)Smad復(fù)合物與靶位點(diǎn)的結(jié)合強(qiáng)度并激活靶基因，從而對(duì)細(xì)胞的分化、細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡和惡性轉(zhuǎn)化起作用［11］。

本研究選用5-氮-2'脫氧胞苷作為甲基化制劑處理白血病Reh細(xì)胞株，5-氮-2'脫氧胞苷可通過(guò)抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)的甲基轉(zhuǎn)移活性從而達(dá)到去甲基化，使多種含有CpG島的高甲基化抑癌基因重新表達(dá)或增強(qiáng)，從而恢復(fù)抑癌功能，如P16基因［12］。本研究結(jié)果顯示，MTT法檢測(cè)到經(jīng)過(guò)不同濃度5-氮-2'脫氧胞苷處理后，Reh細(xì)胞生長(zhǎng)增殖活性受到了抑制，且細(xì)胞增殖抑制率隨著藥物濃度增大和作用時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)。MSP法檢測(cè)到RUNX3基因啟動(dòng)子在5-氮-2'脫氧胞苷未干預(yù)的Reh細(xì)胞中是甲基化的，RT-PCR法檢測(cè)到 Reh細(xì)胞中RUNX3 mRNA未見(jiàn)表達(dá)，經(jīng)過(guò)不同濃度5-氮-2'脫氧胞苷處理后，RUNX3基因啟動(dòng)子甲基化區(qū)域出現(xiàn)部分去甲基化，而RUNX3 mRNA可見(jiàn)重新表達(dá)。當(dāng)然5-氮-2'脫氧胞苷本身存在的細(xì)胞毒性也可能導(dǎo)致類似作用，目前研究表明，有細(xì)胞毒性的藥物，其細(xì)胞毒性均存在時(shí)效性，而未發(fā)現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的可遺傳性［13］。本實(shí)驗(yàn)所用Reh細(xì)胞是5-氮-2'脫氧胞苷作用后繼續(xù)培養(yǎng)5 d以上的，證實(shí)Reh細(xì)胞生長(zhǎng)增殖活性的抑制作用并非由5-氮-2'脫氧胞苷本身藥物毒性直接決定的，而是去甲基化的間接作用，從而進(jìn)一步論證了抑癌基因RUNX3不表達(dá)的主要機(jī)制是RUNX3基因啟動(dòng)子的異常甲基化，RUNX3基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化參與了急性白血病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，去甲基化抑制劑5-氮-2'脫氧胞苷通過(guò)重新激活因甲基化處于沉默的RUNX3抑癌基因的轉(zhuǎn)錄活性，恢復(fù)了RUNX3基因的表達(dá)，因此RUNX3啟動(dòng)子的異常甲基化可能是急性白血病發(fā)病機(jī)制之一。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明去甲基化藥物5-氮-2'脫氧胞苷能夠使白血病Reh細(xì)胞RUNX3基因甲基化程度降低，激活RUNX3基因重新表達(dá)，抑制白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，為RUNX3成為白血病基因治療的新靶點(diǎn)提供分子依據(jù)，從而為進(jìn)一步用誘導(dǎo)沉默的RUNX3基因重新表達(dá)的方法對(duì)白血病進(jìn)行基因治療打下理論基礎(chǔ)。

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