李 曙，張根葆，2，李 偉

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.病理生理學(xué)教研室;2.蛇毒研究所，安徽 蕪湖 241002)

蛇毒是多種生物活性蛋白和多肽的混合物，其中許多組分有明顯的促凝血或抗凝血、促血栓形成或溶解血栓、促血小板聚集或抗血小板聚集等功能，特別是蝮科和蝰科蛇毒對(duì)血液循環(huán)功能的影響尤為明顯［1］。近年來本室從蝮蛇粗毒中分離純化出一種分子量約14～17 ku的具有抗凝活性的蛋白質(zhì)，其可特異性激活血漿中蛋白C(PC)從而發(fā)揮抗凝活性?，F(xiàn)通過制備的家兔體外血栓、大鼠半體內(nèi)血栓及檢測(cè)血漿凝血功能有關(guān)指標(biāo)，來研究其抗栓效應(yīng)并報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與主要儀器 PCA通過離子交換層析法從皖南山區(qū)的蝮蛇粗毒中提取;月桂酸鈉(上海潤捷化學(xué)試劑有限公司);TEG?5000型血栓彈力儀系統(tǒng)(美國 Haemoscope Corporation);LBY-F/S5血栓形成儀(北京普利生儀器中心);MC-2000雙通道血凝儀(德國美創(chuàng));阿司匹林腸溶片(進(jìn)口分裝，批號(hào)BJ02993)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康家兔40只(體重2.5 kg左右);SD雄性大鼠60只(體重220 g左右)，由本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 動(dòng)物模型的復(fù)制和血栓的制備

1.2.1 大鼠冠狀動(dòng)脈微血栓模型的復(fù)制 SD雄性大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(0.1 ml/100 g)后，固定，分離頸部，氣管插管，呼吸機(jī)輔助通氣(呼吸頻率54次/min，潮氣量2 ml/100 g)，沿胸骨左緣剪開第二肋骨，暴露心臟，分離主動(dòng)脈并用血管夾夾閉主動(dòng)脈根部，迅速以微量注射器從心尖部直接向左心室注入月桂酸鈉1.0 mg/kg(濃度10 mg/ml);夾閉20 s后，松開血管夾，心跳穩(wěn)定后逐層關(guān)胸［2］。

1.2.2 動(dòng)物分組與給藥 健康雄性 SD大鼠60只，隨機(jī)分為假手術(shù)(SH)組、心肌梗死模型(MI)組、PCA 干預(yù)組(MI+PCA 組分為0.5 mg/kg、2 mg/kg、8 mg/kg 3個(gè)劑量組)、陽性對(duì)照組(阿司匹林5 mg/kg)［3］，每組10只。微血栓模型復(fù)制10 min后，MI+PCA組舌靜脈注入不同劑量同體積的PCA組分;而MI組只注入同體積生理鹽水，陽性對(duì)照組注入同體積的5 mg/kg的阿司匹林;SH組不復(fù)制微血栓模型，僅以微量注射器從心尖部直接向左心室注入生理鹽水，10 min后舌靜脈分別注入同體積的生理鹽水。

1.2.3 血栓制備 用 Chandler法［4］制備的家兔體外血栓模型的抗栓實(shí)驗(yàn):取家兔40只，隨機(jī)分為4組，每組10只，各兔靜脈注射3%戊巴比妥鈉麻醉。分離家兔頸總動(dòng)脈，在1 min內(nèi)取1 ml注入血栓形成儀(硅化)聚乙烯管中，同時(shí)將 50 μl、30 μl、10 μl(0.6216 mg/ml)蝮蛇毒PCA組分大、中、小3個(gè)劑量注入各給藥組管中;對(duì)照組注入相同體積生理鹽水，37℃條件下以16 r/min在恒流泵上旋轉(zhuǎn)制備血栓。然后傾出血栓，用濾紙吸干水份，稱取血栓濕重，后放入烘箱，60℃烘烤15 min，稱血栓干重。

用Chandler法制備大鼠半體內(nèi)血栓模型的抗栓實(shí)驗(yàn):各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物均于術(shù)后3 h頸總動(dòng)脈取血，按上述方法制備血栓，觀察其大鼠半體內(nèi)血栓模型的抗栓效應(yīng)。

1.2.4 凝血功能 取血、抗凝、離心(1 000 r/min，10 min)。按照儀器規(guī)程分別測(cè)定血漿凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、纖維蛋白原(FIB)、凝血酶時(shí)間(TT)，在采血后2 h內(nèi)測(cè)定完畢。

2 結(jié)果

2.1 蝮蛇毒PCA組分對(duì)體外血栓的影響，見表1和圖1。

表1 蝮蛇毒PCA組分對(duì)家兔體外血栓的影響(±s，n=10)Tab 1 Effects of PCA on thrombus in the plasma of rabbits in vitro(±s，n=10)

表1 蝮蛇毒PCA組分對(duì)家兔體外血栓的影響(±s，n=10)Tab 1 Effects of PCA on thrombus in the plasma of rabbits in vitro(±s，n=10)

注:秩和檢驗(yàn)，大中小劑量組分別與對(duì)照組比較，字母不同表示P ＜0.05，字母相同表示 P ＞0.05

組別 劑量(0.6106 mg/ml)血栓濕重(mg)血栓干重(mg)長度(cm)對(duì)照組 0 138.7 ±11.6a72.4 ±9.9a 2.2 ±0.3a小劑量組 10 91.9 ±7.3b50.5 ±18.3b1.9 ±0.3b中劑量組 30 75.0 ±5.9c 38.3 ±2.4c 1.5 ±0.1c大劑量組 50 0d 0d 0d

從表1可見蝮蛇毒PCA組分大、中、小三劑量組與對(duì)照組相比較，血栓的干、濕重量及長度均比對(duì)照組減輕(P＜0.05)。表明蝮蛇毒PCA組分對(duì)家兔體外血栓模型有明顯的抗栓效應(yīng)。

2.2 蝮蛇毒PCA組分對(duì)大鼠半體外血栓的影響，見表2和圖2。

表2 蝮蛇毒PCA組分對(duì)大鼠半體外血栓的影響(±s，n=10)Tab 2 Effects of PCA on thrombus in the plasma of rats in vitro(±s，n=10)

表2 蝮蛇毒PCA組分對(duì)大鼠半體外血栓的影響(±s，n=10)Tab 2 Effects of PCA on thrombus in the plasma of rats in vitro(±s，n=10)

注:兩兩之間比較，經(jīng)q檢驗(yàn)，字母不同表示P＜0.05，字母相同表示 P ＞0.05

組別 血栓濕重(cm) 血栓干重(cm) 長度(cm)SH 組 101.6 ±34.1a 53.2 ±18.3a 2.1 ±0.5a 0.000 0.000 0.000 MI組 244.9 ±25.9b 126.1 ±17.4b 10.0 ±0.9b陽性對(duì)照 138.1 ±22.1c 63.2 ±10.1c 2.3 ±0.3a MI+PCA組0.5 mg/kg 255.8 ±33.5b 129.9 ±19.9b 9.9 ±1.4b 2 mg/kg 173.4 ±23.7c 78.5 ±12.2c 3.4 ±0.5c 8 mg/kg 151.5 ±21.6c 67.3 ±12.2c 2.9 ±0.4a F 值 50.118 46.348 244.159 P值

從表2可見，MI+PCA組(2 mg/kg、8 mg/kg)與MI組比較，血栓的干、濕重量長度均有明顯差異(P ＜0.05)，與陽性對(duì)照組無差異(P ＞0.05)?？烧f明PCA組分對(duì)大鼠半體內(nèi)血栓模型有明顯的抗栓效應(yīng)。

圖1 蝮蛇毒PCA組分對(duì)家兔體外血栓的影響(±s，n=10)Fig1 Effects of PCA on thrombus in the plasma of rabbits in vitro(±s，n=10)

圖2 蝮蛇毒PCA組分對(duì)大鼠半體外血栓的影響(±s，n=10)Fig2 Influence of PCA on thrombus in the plasma of rats in vitro(±s，n=10)

2.3 蝮蛇毒PCA組分對(duì)大鼠凝血功能的影響，見表3。從表3可見，MI+PCA組(2 mg/kg、8 mg/kg)與MI組比較，PT、APTT均明顯增高(P＜0.05)，F(xiàn)IB顯著降低(P＜0.05)，TT差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);MI組與 SH 組比較，PT、APTT均明顯降低(P ＜0.05)，F(xiàn)IB 顯著增高(P ＜0.05)。

表3 蝮蛇毒PCA組分對(duì)大鼠凝血功能的影響(±s)Tab 3 Effects of PCA on the blood coagulation of rats(±s)

表3 蝮蛇毒PCA組分對(duì)大鼠凝血功能的影響(±s)Tab 3 Effects of PCA on the blood coagulation of rats(±s)

注:與 SH組比較，*P ＜0.05;與 MI組比較，#P ＜0.05

組別 n PT(s) APTT(s) TT(s) FIB(g/L)SH 組 10 16.21 ±0.63# 33.25 ±2.10# 15.72 ±1.13 1.92 ±0.18#0.000 0.000 0.576 0.000 MI組 10 10.72 ±0.52* 14.67 ±1.54* 16.19 ±2.02 5.50 ±0.25*陽性對(duì)照 10 15.63 ±0.54# 31.56 ±3.57# 15.84 ±1.17 2.30 ±0.21*#MI+PCA 組(0.5 mg/kg) 10 10.61 ±0.66* 16.33 ±2.19* 15.42 ±1.71 5.59 ±0.35*MI+PCA 組(2 mg/kg) 10 14.68 ±0.65*# 28.28 ±2.12*# 16.57 ±1.19 2.45 ±0.19*#MI+PCA 組(8 mg/kg) 10 15.93 ±0.84# 31.96 ±2.47# 15.84 ±1.17 2.30 ±0.27*#F 值 161.559 118.933 0.770 476.105 P值

3 討論

本室多年來一直從事皖南地區(qū)蝮蛇毒提取物的應(yīng)用研究，并做了大量的前期工作和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，積累了一定經(jīng)驗(yàn)，對(duì)于皖南蝮蛇毒PCA的分離純化技術(shù)較為成熟，并多次分離純化出蝮蛇毒PCA組分。本研究以現(xiàn)有方法技術(shù)及條件可比較穩(wěn)定地從皖南地區(qū)AHV粗毒中分離純化出PCA抗凝組分［5］。PC系統(tǒng)是存在于人血漿中的天然抗凝系統(tǒng)，是體液抗凝的主要成分之一。

近年來，隨著社會(huì)人口的老齡化和生活水平的不斷提高，各種血栓性疾病的發(fā)病率逐年升高，病死率已躍居首位。而血小板功能的亢進(jìn)是血栓性疾病的直接危險(xiǎn)因素。迄今達(dá)成共識(shí)的是:所有血栓，無論發(fā)生在動(dòng)脈或靜脈，都是由血小板粘附于血管壁內(nèi)膜開始的。血小板參與血栓形成過程的許多環(huán)節(jié)，在血栓形成過程中起核心作用［6～8］。實(shí)驗(yàn)中月桂酸鈉制造的外周動(dòng)脈血栓模型依靠月桂酸鈉強(qiáng)烈的內(nèi)皮損傷作用，可造成內(nèi)皮的脫落，甚至穿孔;觸發(fā)炎癥性介質(zhì)如白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、炎癥反應(yīng)性蛋白、粘附分子等的釋放后觸發(fā)血小板活化，機(jī)體的這種改變使血液處于高凝狀態(tài)。早在1865年，德國病理學(xué)家Virchow就已提出血栓形成的三要素，即:①血管壁的改變，②血流的改變(血流的緩慢、停止或者形成渦流)，③血液成份性質(zhì)的改變。后者常與血液中血小板、凝血因子、纖溶系統(tǒng)的功能有關(guān)。

凝血四項(xiàng)分別反映的是外源凝血系統(tǒng)、內(nèi)源凝血系統(tǒng)、抗凝系統(tǒng)及纖溶系統(tǒng)的功能。實(shí)驗(yàn)心梗模型大鼠凝血因子均有明顯增加，纖溶系統(tǒng)也相應(yīng)改變，纖溶活性降低。在蝮蛇毒PCA組分干預(yù)后，有效改善了血液的高凝狀態(tài)。

Chandler體外法制備的血栓在塑料管內(nèi)形成，血流速度恒定，故上述之因素中血管壁的變化、血流的變化是穩(wěn)定不變的，唯一變化的是血液的成份性質(zhì)。體外及半體外的血栓制備結(jié)果顯示，干預(yù)組、給藥組形成的血栓的干濕重及長度都比模型組、對(duì)照組血栓的干、濕重減輕(P＜0.05)，長度也明顯變短(P＜0.05)。凝血功能檢測(cè)顯示MI+PCA組(2 mg/kg、8 mg/kg)與MI組比較，PT、APTT均明顯增高(P＜0.05)，F(xiàn)IB 顯著降低(P ＜0.05)。這些結(jié)果充分論證了我室提取的PCA抗凝組分有效改善了血液流變學(xué)特性，抑制血小板等成分形成血栓［9～11］，具體通過何種途徑改變血小板活性還有待進(jìn)一步研究。

［1］候力強(qiáng)，趙路寧，黃劭，等.國產(chǎn)蝮蛇毒蛋白C活化組份的分離提取及生物學(xué)活性鑒定［J］.廣州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1998，26(5):1－5.

［2］葉明芳，陳良龍，陳丹，等.大鼠冠狀動(dòng)脈微血栓模型［J］.福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，37(1):58 －59.

［3］湯晴，朱天義.阿司匹林對(duì)鼠肝細(xì)胞癌形成抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國實(shí)用內(nèi)科雜志，2005，25(12):1110 －1111.

［4］CHANDLER AB.in vitro thrombotic coagulation of the blood a method for producing a thrombus［J］.Lab Inrest，1958，7:110 －114.

［5］張根葆，陳冬云，周志泳，等.蝮蛇毒蛋白C激活物的純化與抗血小板活性［J］.皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，24(1):8 －10.

［6］NASSAR T，SACHAISBS，AKKAWI S，et al.Platelet factor 4 enhances the binding of oxidized low density lipop rotein to vascular wall cells［J］.J B iol Chem，2003，278(8):6187 －6193.

［7］胡大一.重視血栓性疾病的預(yù)防［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)刊，2004，6(2):92－93.

［8］LEYS D.Atherothrombosis-the neurologist's point of view［J］.Vasc Med，2001，69(3):17 －19.

［9］MUNAY JC，KELLY MA，GORLICK PB.A new antiplatelet agent for the secondary prevention of stroke［J］.Clin Neuropharmacol，1994，17:23 －31.

［10］郭詠梅，劉秀娥，李光來.阿司匹林對(duì)血小板聚集研究［J］.臨床醫(yī)藥實(shí)踐雜志，2003，12(1):13 －15.

［11］陳秋生，梁澤華，何康.抗凝血酶Ⅲ對(duì)家兔靜脈血栓形成的實(shí)驗(yàn)研究［J］.實(shí)驗(yàn)研究，2010，7(33):17－18.