宦才娟，汪萌芽

(皖南醫(yī)學(xué)院 細胞電生理研究室，安徽 蕪湖 241002)

咪達唑侖(Midazolam)是當前臨床使用的唯一水溶性苯二氮艸卓(BZ)類藥，依劑量的不同而具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗焦慮、抗驚厥、抗癲癇及中樞肌松等作用［1］。咪達唑侖具有起效快、蘇醒快，對呼吸和循環(huán)功能干擾少，安全有效等特點，是較理想的靜脈麻醉藥，有廣泛的應(yīng)用前景［2］。盡管臨床觀察發(fā)現(xiàn)靜脈注射咪達唑侖顯示鎮(zhèn)痛作用［3］，但有關(guān)咪達唑侖鎮(zhèn)痛作用中是否涉及對脊髓運動神經(jīng)元(motoneuron，MN)的影響，目前國內(nèi)外尚未見研究報道。本文應(yīng)用細胞內(nèi)記錄技術(shù)，觀察咪達唑侖對新生大鼠脊髓切片MN的作用。

1 材料與方法

1.1 新生大鼠脊髓切片的制備 取8～14 d齡新生SD大鼠(雌雄不拘，由南京青龍山動物養(yǎng)殖場提供)，參照報道方法［4］，經(jīng)乙醚麻醉后行椎板切除術(shù)，分離出含腰骶膨大的脊髓節(jié)段后，將脊髓用膠水(crazy glue)固定在瓊脂塊上，再將瓊脂塊固定于振蕩切片機(Vibratome)的冰浴載物浴碟內(nèi)，用剃須刀片橫向切取厚度為400～500 μm的脊髓切片若干，在室溫下置于用混合氣體(95%O2+5%CO2)飽和的人工腦脊液(ACSF)中孵育、備用。在制備脊髓切片過程中，用0～4℃并經(jīng)混合氣體飽和的ACSF浸浴離體的脊髓節(jié)段，整個過程控制在15 min以內(nèi)。ACSF 的成分為(mmol/L):NaCl 127.0，KCl 1.9，KH2PO41.2，CaCl22.4，MgSO4·7H2O 1.3，NaHCO326.0，Glucose·H2O 10.0，pH 7.4。

1.2 新生大鼠脊髓MN的細胞內(nèi)記錄 新生大鼠脊髓切片于室溫下孵育40～60 min后，用吸管移入自制的全浸式記錄浴槽，用上、下兩個絲網(wǎng)相夾固定，持續(xù)灌流經(jīng)混合氣體飽和的ACSF，浴槽中灌流液的溫度為室溫(22～25℃)。用P-97程控微電極拉制儀(Sutter Instrument Co.，USA)拉制含纖維玻璃微電極，內(nèi)充3 mol/L乙酸鉀，固定于微操縱儀(MP-1，Narishige，Japan)上，將探頭(headstage)上的銀絲插入電極尾端內(nèi)，用于胞內(nèi)電流注入及電位記錄。選用尖端阻抗為70～120 MΩ的微電極，在體視顯微鏡下經(jīng)微操縱儀對脊髓切片中腹角MN區(qū)域進行細胞穿刺。緩慢手動推進微電極，當微電極壓在細胞膜上時，通過 Axoclamp-2B微電極放大器(Axon Instrument Inc.，USA)的附設(shè)遙控 裝置(Buzz)進行觸發(fā)，引發(fā)電極尖端的電磁振蕩可使微電極刺入細胞內(nèi)。記錄到的膜電位信號經(jīng)微電極放大器用橋平衡模式進行放大，橋平衡模式可經(jīng)同一電極同時進行膜電位記錄和電流注入。放大的膜電位信號經(jīng)Digidata 1200接口(Axon Instrument Inc.，USA)輸入計算機，用pClamp 7.0軟件(Axon Instruments Inc.，USA)進行采樣、記錄并保存。

1.3 電刺激方法 細胞內(nèi)電流注射:在微機內(nèi)由pClamp 7.0 軟件(Axon Instruments Inc.，USA)程序設(shè)定，由微機觸發(fā)，信號經(jīng)Digidata 1200聯(lián)機接口輸入微電極放大器后，刺激電流由探頭輸出經(jīng)微電極注入細胞內(nèi)。

腹外側(cè)索(VLF)、背根(DR)及腹根(VR)電刺激:由三通道電刺激器(Nihon Kohden，Japan)產(chǎn)生的方波脈沖分別經(jīng)刺激器中一個通道輸出，經(jīng)隔離器(Nihon Kohden，Japan)以恒壓模式至同芯雙極刺激電極(Frederick Haer＆ Co.，USA)。刺激電極尖端放置到脊髓切片的腹外側(cè)索區(qū)、背根和腹根殘端上，用于激活下行、背根傳入和腹根纖維。

1.4 給藥方法 咪達唑侖注射液(徐州恩華藥業(yè)有限公司)，實驗時臨時用ACSF配制成所需濃度0.1、0.3、1.0 mmol/L，由恒流泵灌流給藥，全程用混合氣體飽和，灌流用藥的前后條件(如灌流的速度與溫度等)保持一致。每種濃度灌流15 min，最后用ACSF洗脫。

1.5 分析方法 記錄到的資料，用pClamp 8.0中的 Clampfit 8.1 軟件(Axon Instruments Inc.，USA)進行處理，數(shù)據(jù)分析用Origin 5.0軟件。數(shù)據(jù)以±s表示，統(tǒng)計學(xué)顯著性檢驗采用配對t檢驗，P＜0.05為有顯著性意義。

2 結(jié)果

選取靜息電位(resting potential，RP)負于－60 mV且動作電位有超射，記錄穩(wěn)定的細胞，通過加在腹根殘端上的同芯雙極刺激電極進行逆行激活鑒定，若記錄到具有全或無特點的動作電位(逆行AP)或碰撞試驗陽性，即鑒定為MN，并進行如下實驗和分析。

2.1 咪達唑侖對MN電學(xué)特性的影響 在5個MN，給予0.1 ～1.0 mmol/L的咪達唑侖累積灌流每一濃度各15 min，觀察用藥前后膜電生理參數(shù)，結(jié)果見表1?？梢娺溥_唑侖產(chǎn)生濃度依賴性去極化作用(配對 t測驗，P ＜0.05 或 P ＜0.01)，在 0.3 mmol/L濃度作用時斜率電阻的增大有顯著性意義(n=5，P ＜0.05)，作用可逆。

2.2 咪達唑侖對MN動作電位的影響 對5個誘發(fā)出動作電位的MN，給予0.1～1.0 mmol/L的咪達唑侖累積灌流各15 min，結(jié)果顯示動作電位的幅度和超射值隨著濃度的增加而逐漸降低，1.0 mmol/L的咪達唑侖完全取消了動作電位的發(fā)放(表1、圖1)。

圖1 咪達唑侖可逆性并濃度依賴性抑制MN的動作電位Fig 1 Reversibly and concentration-dependently inhibitory action of midazolam on action potential in a MN in vitro.RP was－73 mV

表1 咪達唑侖對MN電生理參數(shù)的影響(±s，n=5)Tab 1 Effects of midazolam on electrophysiological properties of neonatal rat spinal cord MNs in vitro(±s，n=5)

表1 咪達唑侖對MN電生理參數(shù)的影響(±s，n=5)Tab 1 Effects of midazolam on electrophysiological properties of neonatal rat spinal cord MNs in vitro(±s，n=5)

與對照組比較:*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01，## 完全取消

Control Midazolam(mmol/L)(n=5) 0.1(n=4) 0.3(n=5) 1.0(n=2)Resting potential(mV) －71.1 ±9.4 －53.2 ±13.0* －47.8 ±10.7＊＊1.4 ±0.6 2.8 ±2.4 1.3 ±0.4 ##－36.0 ±8.5 Membrane resistance(MΩ) 49.4 ±8.2 51.6 ±9.7 58.0 ±11.0* 61.0 ±2.5 Time constant(ms) 11.5 ±3.9 14.7 ±6.7 14.8 ±4.0 14.6 ±7.3 Action potential Amplitude(mV) 76.3 ±9.1 63.7 ±15.5 52.4 ±15.7 ##Threshold(mV) －53.0 ±12.3 －40.7 ±11.3 －35.3 ±1.9 ##Overshoot(mV) 14.6 ±7.4 27.2 ±7.0 ## ##Spike potential Amplitude(mV) 59.8 ±7.9 54.8 ±14.7＊＊ 38.0 ±34.8* ##Half-width(ms) 1.4 ±0.4 2.3 ±1.3 1.4 ±0.3 ##Max L.slope(mV/ms) 130.9 ±37.8 101.9 ±54.9* 141.7 ±52.4 ##Max R.slope(mV/ms) －69.7±28.7 －63.2 ±27.0 －53.4±20.0 ##Rise Time(ms) 0.6 ±0.1 1.0 ±0.7 0.6 ±0.2 ##Decay Time(ms)

2.3 咪達唑侖對MN動作電位發(fā)放頻率的影響對實驗中記錄到的MN給予不同強度(0.1～1.3 nA，300 ms)的細胞內(nèi)去極化脈沖，大部分MN的放電頻率呈現(xiàn)與電流強度相關(guān)性升高(I-F關(guān)系曲線)，對于其中 5 個 MN 給予 0.1、0.3 mmol/L 咪達唑侖灌流，觀察到MN的I-F關(guān)系曲線右移、斜率降低(圖 2)，其中 0.3 mmol/L 咪達唑侖對 0.2 ～0.6 nA時的放電頻率抑制有統(tǒng)計學(xué)意義(n=5，P＜0.05)，說明咪達唑侖濃度依賴性抑制MN的動作電位發(fā)放頻率。

圖2 咪達唑侖對MN動作電位發(fā)放頻率的影響Fig 2 Effects of midazolam on current intensity-firing frequency(I-F)in a MN

2.4 咪達唑侖對MN背根興奮性突觸后電位的影響 在記錄到背根電刺激誘發(fā)出興奮性突觸后電位(DR-EPSP)的4 個 MN，給予0.1 ～ 1.0 mmol/L 的咪達唑侖各累積灌流15 min，觀察到咪達唑侖對DR-EPSP呈現(xiàn)可逆性抑制作用(圖3、表2)，其中0.1 mmol/L的咪達唑侖的抑制作用有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(n=3，P ＜0.05)，并呈濃度依賴性特征(圖4)。另外，在記錄到DR-EPSP合并抑制性突觸后電位(DR-IPSP)的3個 MN，給予 0.1 ～ 1.0 mmol/L咪達唑侖各累積灌流15 min，隨著濃度增大DR-EPSP逐漸被抑制，而 DR-IPSP的幅度增大，但在1.0 mmol/L濃度DR-IPSP也被完全取消，作用可被ACSF部分洗出。一個細胞的典型記錄例示于圖5。

表2 咪達唑侖對MN DR-EPSP的影響(±s，n=4)Tab 2 Effects of midazolam on DR-EPSP of rat spinal cord MNs in vitro(±s，n=4)

表2 咪達唑侖對MN DR-EPSP的影響(±s，n=4)Tab 2 Effects of midazolam on DR-EPSP of rat spinal cord MNs in vitro(±s，n=4)

與對照組比較:*P＜0.05，##完全取消

Control Midazolam(mmol/L)(n=4) 0.1(n=3) 0.3(n=2) 1.0(n=2)Amplitude(mV) 5.9 ±2.3 1.7 ±1.8*－12.3 ±13.2 －3.3 ±2.9 －0.9 ±1.3 ##1.0 ±1.4 ##Area under curve(mV·ms) 241.6 ±210.9 82.0 ±107.2 36.0 ±50.9 ##Duration(ms) 84.7 ±51.3 86.5 ±95.4 39.0 ±55.2 ##Latency(ms) 6.7 ±4.1 3.3 ±3.7 4.8 ±6.7 ##Half-width(ms) 19.0 ±15.8 2.4 ±3.4 8.9 ±12.6 ##Max L.slope(mV/ms) 7.0 ±4.9 3.5 ±3.2 0.8 ±1.1 ##Max R.slope(mV/ms)

圖3 咪達唑侖(0.1 mmol/L)對MN DR-EPSP的可逆性抑制作用Fig 3 Reversible action of midazolam(0.1mmol/L)on DR-EPSP in a MN in vitro

圖4 咪達唑侖(0.3，1.0 mmol/L)濃度依賴性抑制 MN的DR-EPSPFig 4 Concentration-dependently inhibitory action of midazolam on DR-EPSPs in a MN in vitro

圖5 不同濃度咪達唑侖對MN DR-EPSP復(fù)合DR-IPSP的作用Fig 5 Effects of midazolam on DR-EPSP and DR-IPSP in a MN in vitro

3 討論

本實驗運用細胞內(nèi)記錄技術(shù)，觀察到咪達唑侖對新生大鼠脊髓切片MN膜電學(xué)性質(zhì)、動作電位和電刺激背根產(chǎn)生的DR-EPSP均具有可逆性抑制作用，這可能與咪達唑侖增強GABAA受體活性、阻斷Na+通道等作用有關(guān)。

咪達唑侖是臨床上常用的一種苯二氮艸卓類(BZ)靜脈麻醉藥，BZ受體是GABAA受體主要識別位點之一，位于神經(jīng)元的突觸膜上，與GABAA受體相鄰并耦聯(lián)于共同的Cl－通道。與異丙酚復(fù)合應(yīng)用于手術(shù)病人全身麻醉［5］，具有良好的鎮(zhèn)靜作用。目前認為其麻醉作用的分子機制與神經(jīng)細胞膜上離子通道的活性變化有關(guān)［6］。多年來，γ-氨基丁酸(GA-BA)受體及其門控的Cl－通道復(fù)合物一直是全麻機制的研究焦點。BZ類藥物可與其相應(yīng)位點結(jié)合，使受體發(fā)生變構(gòu)，促進GABA與低親和力的GABA位點結(jié)合起到增強抑制的效果［7］。在對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制作用中，有研究［8］顯示咪達唑侖與GABAA受體復(fù)合體中的BZ位點結(jié)合數(shù)目越多，其藥理作用也越強，原因可能是咪達唑侖與BZ受體結(jié)合后增強GABA與GABAA受體結(jié)合，使神經(jīng)元上Cl－通道開放，促使Cl－內(nèi)流，形成神經(jīng)細胞膜的超極化狀態(tài)，從而減少了神經(jīng)元的興奮性遞質(zhì)的釋放，同時抑制了腦內(nèi)神經(jīng)突觸對GABA的重攝取。由此可見，本文觀察到咪達唑侖抑制脊髓MN的DR-EPSP的作用，可能是咪達唑侖作用于GABAA受體的結(jié)果，特別是在低濃度時，既抑制DR-EPSP又增強DR-IPSP的結(jié)果，為此提供了直接的證據(jù)。

在我們的實驗中，咪達唑侖對脊髓MN的膜電生理特性有影響，能引起去極化反應(yīng)，并有抑制AP的幅度的趨勢，同時對刺激脊髓背根產(chǎn)生的EPSP具有明顯的抑制作用。有關(guān)高濃度咪達唑侖同時可取消動作電位、DR-EPSP和DR-IPSP的作用，顯然不可能是增強GABAA受體作用所致。已有研究表明臨床濃度的咪達唑侖對交感神經(jīng)元鈉通道電流具有抑制作用［9］。也有研究［10］表明咪達唑侖對Ca2+和K+通道具有抑制作用。本文觀察到咪達唑侖對細胞內(nèi)去極化電流刺激誘發(fā)的動作電位具有濃度依賴性抑制作用，在高濃度完全取消動作電位的發(fā)放，結(jié)合高濃度咪達唑侖也完全取消DR-IPSP的作用，表明高濃度咪達唑侖的作用，至少涉及Na+通道的阻斷作用。

咪達唑侖與異丙酚已經(jīng)被廣泛聯(lián)合運用于臨床麻醉中，兩藥聯(lián)合運用既可確保患者產(chǎn)生鎮(zhèn)靜-遺忘效應(yīng)，又有利于減少各自的用量，降低藥物不良反應(yīng)［11］，而我們實驗室前期的研究顯示臨床濃度異丙酚對離體脊髓運動神經(jīng)元有抑制作用，且認為高濃度時通過直接抑制谷氨酸受體而起作用［12］。結(jié)合本文對咪達唑侖作用的觀察，提示咪達唑侖可能在MN靶點上與異丙酚有協(xié)同作用，其具體機制仍需進一步研究。

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