孫紅亞,朱琦峰,傅應(yīng)華#(1.浙江寧波市鄞州人民醫(yī)院,寧波市315040;.嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院,嘉興市314001)
長春西汀是一種腦血管擴(kuò)張藥,其原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)——進(jìn)口藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)[1]中收載了乙酸乙酯殘留溶劑檢測項(xiàng)目,方法為以吡啶為溶劑、二氧六環(huán)為內(nèi)標(biāo)直接進(jìn)樣測定,并規(guī)定了乙酸乙酯殘留溶劑限度為0.1%。筆者按該方法對長春西汀原料藥進(jìn)行乙酸乙酯檢測時(shí)發(fā)現(xiàn),因?qū)φ掌啡芤褐幸宜嵋阴舛鹊?,直接進(jìn)樣存在檢測靈敏度低、峰面積小、重現(xiàn)性差、溶劑吡啶中雜質(zhì)有干擾等問題,文獻(xiàn)也未見有關(guān)長春西汀殘留溶劑檢測方法報(bào)道。有關(guān)殘留溶劑測定有直接進(jìn)樣法[2]和頂空進(jìn)樣法[3,4]2種,為了提高檢測靈敏度和準(zhǔn)確度,筆者根據(jù)《中國藥典》2010年版(二部)殘留溶劑測定法[5]的要求,對長春西汀中乙酸乙酯殘留溶劑檢測方法進(jìn)行了改進(jìn)研究:采用頂空進(jìn)樣法,以二氧六環(huán)代替吡啶為溶劑,建立了以丙酮為內(nèi)標(biāo)的毛細(xì)管氣相色譜法測定長春西汀中乙酸乙酯殘留量,并對系統(tǒng)適用性進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明方法簡單、靈敏、準(zhǔn)確,可用于長春西汀原料藥中乙酸乙酯殘留量檢測。
6890N毛細(xì)管氣相色譜儀,包括氫火焰離子化檢測器(FID)、HP7694E頂空進(jìn)樣器(美國Aglient公司);BP211D電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。
長春西汀原料藥(6批均為進(jìn)口。瑞士Linnea SA公司,批號:41809007、41809015、41809021,含量:99.5%、99.9%、99.2%;西班牙 Covex公司,批號:VP/VP070701、VP/VP/VP070901、CH080615GCH,含量:100.3%、99.5%、99.1%);乙酸乙酯、丙酮均為分析純,二氧六環(huán)為色譜純。
色譜柱:AgilentDB-624彈性石英毛細(xì)管柱(固定液為6%腈丙基苯基-94%聚二甲基硅氧烷,50m×0.535mm×3.00μm);柱溫:程序升溫,初始溫度55℃,保持6m in,并以40℃·m in-1速率升溫至180℃,保持2m in;載氣:高純氮?dú)?,流速?.0m L·m in-1;進(jìn)樣口溫度:200 ℃;FID檢測口溫度:250 ℃;進(jìn)樣方式:分流進(jìn)樣,分流比:5∶1;頂空溫度:85℃;平衡時(shí)間:30 m in;進(jìn)樣時(shí)間:1m in。
取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液、二氧六環(huán)、供試品溶液進(jìn)樣分析,結(jié)果乙酸乙酯與內(nèi)標(biāo)丙酮峰分離良好,分離度大于1.5。色譜見圖1。
圖1 氣相色譜圖A.混合對照品溶液;B.二氧六環(huán);C.供試品溶液;1.內(nèi)標(biāo);2.乙酸乙酯Fig 1 GC chromatogramsA.control solution mixture;B.dioxane;C.sample solution;1.internal standard;2.ethylacetate
精密稱取丙酮適量,用二氧六環(huán)稀釋制成0.2mg·m L-1的溶液,作為內(nèi)標(biāo)貯備液;精密量取貯備液5m L,置于50m L容量瓶中,加二氧六環(huán)至刻度,作為內(nèi)標(biāo)溶液。
精密稱取乙酸乙酯50.06mg,置于100m L容量瓶中,加二氧六環(huán)至刻度,作為對照品貯備液。精密量取對照品貯備液與內(nèi)標(biāo)貯備液各5m L,置于50m L容量瓶中,加二氧六環(huán)至刻度,搖勻;再精密量取10m L,置于20m L頂空瓶中,加蓋密封,作為混合對照品溶液。
取供試品約0.5 g,置于20m L頂空瓶中,精密稱定;再精密加入內(nèi)標(biāo)溶液10m L,加蓋密封,振搖使溶解,作為供試品溶液。
取混合對照品溶液與供試品溶液,于85℃加熱30m in,照《中國藥典》2010年版(二部)附錄殘留溶劑測定法[5],以“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定,按內(nèi)標(biāo)法以峰面積計(jì)算。
精密量取“2.2”項(xiàng)下對照品貯備液0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 m L,分別置于20m L頂空瓶中,各精密加入內(nèi)標(biāo)貯備液1m L,分別加二氧六環(huán)至10m L,搖勻,加蓋密封,依法測定。以乙酸乙酯峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(Y)為縱坐標(biāo),濃度(X,mg·m L-1)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得乙酸乙酯的回歸方程為:Y=10.345X+0.040 2(r=0.999 8)。表明乙酸乙酯檢測濃度線性范圍為0.025~0.25mg·m L-1。
取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液,重復(fù)測定6次,計(jì)算乙酸乙酯峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的平均比值為1.086,RSD=1.08%(n=6),表明精密度良好。
取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液,分別于0、2、4、6、8 h時(shí)各取樣測定,得乙酸乙酯峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值無明顯差別,表明溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。
取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液,用二氧六環(huán)逐級稀釋成不同濃度,依法測定,按S/N=10計(jì)算最低定量濃度為0.10μg·m L-1。
取經(jīng)105℃干燥至恒重的某批樣品約0.5 g,共6份,置于20m L頂空瓶中,精密稱定,分別精密加入“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液10m L,加蓋密封,振搖使溶解,按“2.2”項(xiàng)下方法依法測定,按內(nèi)標(biāo)法以峰面積計(jì)算回收率,得平均回收率為102.2%,RSD=1.82%(n=6),詳見表1。
表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab 1 Resultsof recovery tests(n=6)
精密稱取6批長春西汀原料藥各0.5 g,按照“2.2”項(xiàng)下方法制備混合對照品溶液和供試品溶液,依法測定,結(jié)果批號為41809021的樣品中檢出乙酸乙酯殘留量為0.023%,其余5批均未檢出;同時(shí)取樣按照進(jìn)口藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)方法[1]檢驗(yàn),結(jié)果6批樣品均未檢出乙酸乙酯。
長春西汀易溶于氯仿,在二甲基甲酰胺中略溶。考慮到氯仿毒性大,不宜作為溶劑使用。在前期研究中經(jīng)試驗(yàn)二甲基甲酰胺、二甲基亞砜和二氧六環(huán)3種溶劑,發(fā)現(xiàn)二甲基甲酰胺、二甲基亞砜對長春西汀的溶解度均不能滿足樣品濃度的要求,而二氧六環(huán)對照品的溶解度能達(dá)到5%的要求,故選擇二氧六環(huán)作溶劑。
筆者曾采用丙酮、乙醇、正丙醇作為內(nèi)標(biāo),經(jīng)試驗(yàn)三者均能與乙酸乙酯分離,但正丙醇在二氧六環(huán)溶劑中存在峰形變寬問題,柱效降低,不適合作內(nèi)標(biāo);長春西汀化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有乙醇酯基團(tuán),經(jīng)考察在90℃下加熱30min頂空進(jìn)樣,樣品在乙醇峰位處出現(xiàn)1個(gè)色譜峰,經(jīng)比較確認(rèn)為長春西汀受熱分解產(chǎn)生的乙醇峰,故乙醇不適合作內(nèi)標(biāo);丙酮的保留時(shí)間較為適宜,在給定的色譜條件下,與乙酸乙酯分離良好,其峰形不受溶劑影響,柱效高,故選擇丙酮作為內(nèi)標(biāo)。
筆者曾考察了HP-5、HP-INNOWax和DB-624 3種色譜柱的適用性,結(jié)果表明以DB-624色譜柱效果最好,乙酸乙酯、乙醇、內(nèi)標(biāo)、溶劑峰分離良好,乙酸乙酯、內(nèi)標(biāo)峰形對稱、柱效高、檢測靈敏度高、重現(xiàn)性好,故選擇DB-624為色譜柱。
取混合對照品溶液3份,分別在70、80、85℃下加熱平衡30m in后進(jìn)樣測定。結(jié)果表明,乙酸乙酯和內(nèi)標(biāo)的峰面積隨平衡溫度升高而增大。
另取混合對照品溶液2份,分別在85℃加熱30、45min后進(jìn)樣測定,結(jié)果在平衡30、45min時(shí)測得乙酸乙酯和內(nèi)標(biāo)的峰面積基本不變。故選擇加熱溫度(即頂空溫度)為85℃、平衡時(shí)間為30min。
采用頂空進(jìn)樣法,可大大提高乙酸乙酯的檢測靈敏度,同時(shí)還可減少樣品對色譜柱的污染,延長柱子的使用壽命。采用程序升溫,先在低溫下完成乙酸乙酯和內(nèi)標(biāo)的分離,再提高柱溫,使高沸點(diǎn)溶劑二氧六環(huán)快速出峰,達(dá)到快速分析的目的。
進(jìn)口藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)[1]中規(guī)定長春西汀中乙酸乙酯限量為0.1%,較《中國藥典》2010年版(二部)規(guī)定的乙酸乙酯殘留量限度0.5%低了5倍,因此需要更高的檢測靈敏度。而本法具有檢測靈敏度更高、重復(fù)性和準(zhǔn)確度更好的優(yōu)點(diǎn),可用于長春西汀原料藥中乙酸乙酯殘留量的檢測,也可為長春西汀質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供方法依據(jù)。
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