李楊，施秀芳，王丹丹，張超峰，杜斌#（1.河南省食品藥品檢驗(yàn)所，鄭州市450003；.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，鄭州市 450001）

2-甲氧基雌二醇（2-Methoxyestradiol，2-ME）為雌二醇的生理代謝產(chǎn)物，研究[1]發(fā)現(xiàn)其具有抗多種腫瘤的活性，包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌及造血系統(tǒng)腫瘤白血病及骨髓瘤等。國外關(guān)于該藥的研究已經(jīng)進(jìn)入Ⅱ期臨床階段，國內(nèi)關(guān)于2-ME的報道多集中于合成、藥理、藥動學(xué)及制劑方面的研究[2]，尚未見其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方面的報道。為此，筆者在本文中建立了測定2-ME原料藥中主藥和有關(guān)物質(zhì)含量的高效液相色譜（HPLC）方法，結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確、快速、分離度好、靈敏度高，可用于其質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1200型液相色譜分析儀、紫外-可見檢測器及其分析軟件（美國Agilent公司）。

2-ME 原料藥（批號：090610、090611、090612，純度：＞98.5%）、2-ME對照品（批號：20090722，純度：＞99.5%）均由鄭州大學(xué)藥學(xué)院提供；甲醇為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水＝65∶35，流速：1.0m L·m in－1；柱溫：30℃；檢測波長：285 nm[3]；進(jìn)樣量：20μL。理論板數(shù)按2-ME峰計(jì)算，不得低于3 000。

2.2 線性關(guān)系考察

對照品貯備液的制備：精密稱取2-ME對照品約10mg，置于50m L容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻備用。

精密量取對照品貯備液2.0、3.0、5.0、7.5、10m L，置于10 m L容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜，以濃度（c）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：A＝12.6c－11.8（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，2-ME檢測濃度線性范圍為45.96～229.8 μg·m L－1。

2.3 重復(fù)性與中間精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下對照品貯備液5.0m L置于10m L容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。照“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，計(jì)算其RSD＝0.1%（n＝5）。更換儀器，由不同人員操作，在不同時間測定同一批樣品（批號：090610），含量結(jié)果分別為100.4%、99.8%、100.2%，RSD＝0.3%，可見該方法重復(fù)性和中間精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.8.2”項(xiàng)下的供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、1、2、4、5、8、10 h進(jìn)樣，測得峰面積，計(jì)算其RSD＝0.4%。結(jié)果表明，溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性好。

2.5 破壞性試驗(yàn)[4]

取2-ME原料藥5份，分別進(jìn)行酸破壞（以1mol·L－1鹽酸的甲醇溶液制備2-ME溶液，破壞48 h后，用氫氧化鈉甲醇溶液中和）、堿破壞（以0.1mol·L－1氫氧化鈉的甲醇溶液制備2-ME溶液，破壞48 h后，用鹽酸甲醇溶液中和）、氧化破壞（以3%過氧化氫的甲醇溶液制備2-ME溶液，破壞48 h）（前3種溶液終濃度均為“2.8.1”項(xiàng)下供試品溶液濃度）、高溫破壞（將樣品置于80℃的烘箱中48 h，然后取出，按照“2.8.1”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液）、光照破壞（將一定量的樣品置于8 000 lx強(qiáng)光下照射5 d，然后取出，按照“2.8.1”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液），進(jìn)樣分析，記錄色譜至主成分保留時間的2.5倍。結(jié)果表明，在選定的色譜條件下，2-ME的理論板數(shù)大于3 000，各雜質(zhì)峰與主峰的分離度都大于1.5，供試品在強(qiáng)酸中有所降解，在原有雜質(zhì)與主峰之間又產(chǎn)生2個新雜質(zhì)；在強(qiáng)堿中也有所降解，在產(chǎn)生新雜質(zhì)的同時，原有雜質(zhì)消失；在氧化破壞中，原有雜質(zhì)明顯減少，并在主峰后產(chǎn)生1個新雜質(zhì)峰；光照和高溫下供試品相對穩(wěn)定；且各破壞條件下的降解物均與主峰分離良好，結(jié)果詳見圖1。

圖1 破壞性試驗(yàn)高效液相色譜圖A.未破壞樣品；B.酸破壞后樣品；C.堿破壞后樣品；D.氧化破壞后樣品；E.高溫破壞后樣品；F.光照破壞后樣品；1.2-ME；2.過氧化氫Fig 1 HPLC chromatogramsof destructive testsA.undestroyed sample；B.sample destroyed by acid；C.sample destroyed by alkali；D.sample destroyed by oxidation；E.sample destroyed by high temperature；F.sample destroyed by light；1.2-methoxyestradiol；2.hydrogen peroxide

2.6 回收率試驗(yàn)[5]

取批號為090610的原料藥適量，精密稱定，置于100m L容量瓶中，以甲醇為溶劑，分別制備低、中、高3個濃度（約80、100、120 μg·m L－1）的溶液各3份，作為回收率測定溶液，精密量取20μL，進(jìn)樣分析，記錄色譜；另取對照品適量，精密稱定，用甲醇制成100μg·m L－1的溶液，作為對照品溶液，同法測定。采用外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果，平均回收率為98.9%（RSD＝0.7%），詳見表1。

表1 回收率測定結(jié)果（n＝9）Tab 1 Resultof recovery test（n＝9）

2.7 檢測限和定量限

按照信噪比為3∶1時作為檢測限，結(jié)果為2 ng；按照信噪比為10∶1時作為定量限，結(jié)果為10 ng。

2.8 樣品測定

2.8.1 有關(guān)物質(zhì)[6]。取本品，加甲醇溶解并稀釋制成每1m L中含3mg的溶液作為供試品溶液；精密量取適量，加甲醇制成每1m L中含60μg的溶液，作為對照溶液。取對照溶液20μL注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分峰高為滿量程的20%～25%。再精密量取供試品溶液和對照溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜至主成分峰保留時間的2倍，供試品溶液的色譜中如有雜質(zhì)峰，各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對照溶液的主峰面積（2.0%）。通過自身對照法計(jì)算結(jié)果顯示，3批樣品中雜質(zhì)的峰面積之和均小于對照溶液主峰面積（2.0%），含量分別為1.1%、1.4%、1.5%，均低于2.0%。

2.8.2 主藥含量測定。取2-ME原料藥約10mg，精密稱定，置于100m L容量瓶中，用甲醇適量使之溶解并稀釋至刻度，作為供試品溶液。精密量取20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜。另取對照品適量，精密稱定，用甲醇制成100μg·m L－1的溶液，作為對照品溶液，同法測定。采用外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果3批樣品中主藥的含量均在98%以上，詳見表2。

表2 樣品中主藥含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Resultsof content determ ination of sam ples（n＝3）

3 討論

3.1 分析方法的選擇

由于2-ME有紫外吸收[3]，因此在含量測定時，選擇分離能力強(qiáng)的HPLC法，可同時進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查。根據(jù)相關(guān)指導(dǎo)原則建議，色譜柱首選C18，流動相首選甲醇-水系統(tǒng)。2-ME的紫外光譜（甲醇為溶劑）顯示，其在205、285 nm波長處有最大吸收[7]；由于甲醇的末端吸收也在205 nm波長附近，因此甲醇-水系統(tǒng)不能用205 nm波長進(jìn)行檢測，故選擇285 nm波長進(jìn)行檢測，結(jié)果滿足分析要求。

3.2 有關(guān)物質(zhì)檢查

首先考慮薄層色譜法，根據(jù)合成工藝[8]，以二氯甲烷和丙酮為展開劑，采用硅膠G板，點(diǎn)樣，但未顯現(xiàn)雜質(zhì)斑點(diǎn)。此后更換多種展開劑后，效果均不理想，最好的結(jié)果是采用氯仿-環(huán)己烷-二氧六環(huán)-三乙胺（4.5∶4.1∶0.6∶0.8）為展開劑，以二氧六環(huán)-水（9∶1）為溶劑后，在主斑點(diǎn)下方顯示1個雜質(zhì)斑點(diǎn)，雜質(zhì)個數(shù)少于液相色譜檢出的雜質(zhì)個數(shù)（3個），故最終還是采用液相色譜方法。為了能夠充分顯示雜質(zhì)峰，經(jīng)過多次試驗(yàn)，在保證不過載的前提下，將供試品溶液的濃度設(shè)在3mg·m L－1。根據(jù)《美國藥典》[9]關(guān)于雌激素類的標(biāo)準(zhǔn)控制及多次試驗(yàn)結(jié)果表明，雜質(zhì)的總含量均不大于1.5%。由于2-ME易溶于有機(jī)溶劑[10]，難溶于水，因此在破壞性試驗(yàn)中，酸、堿溶液采用的是甲醇作溶劑。

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