李 明，馬建新，王忠明，侯吉棉，周 杰

江蘇省連云港市第二人民醫(yī)院放療科，江蘇連云港 222023

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7%～10%，全世界每年發(fā)患者數(shù)達(dá)130萬(wàn)例，每年約有50萬(wàn)人死于乳腺癌。近年來(lái)其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，城市中乳腺癌的發(fā)病率為女性惡性腫瘤的第二位，已經(jīng)成為威脅婦女健康的嚴(yán)重疾病之一。隨著科技的發(fā)展，在乳腺癌的治療方面雖取得了一定的進(jìn)展，但仍有較多患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等并發(fā)癥[1]。熱休克蛋白（HSP）是一類(lèi)保守的細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)蛋白，可以被許多不利的情況包括高溫、缺血、缺氧、重金屬、代謝性毒物等多種應(yīng)激所誘導(dǎo)，其作用就是保護(hù)細(xì)胞，參與細(xì)胞損傷的修復(fù)過(guò)程。但熱休克蛋白的表達(dá)同時(shí)也保護(hù)了腫瘤細(xì)胞，使得腫瘤細(xì)胞的輻射敏感性降低，不利于放射治療。槲皮素又名櫟精、槲皮黃素，早期作為祛痰、止咳、降低血壓、增強(qiáng)毛細(xì)血管抵抗力、降血脂等方面的藥物，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、抗炎、消除自由基、抑制熱休克蛋白表達(dá)等多種生物活性[2]。本實(shí)驗(yàn)主要是利用槲皮素抑制熱休克蛋白的表達(dá)來(lái)研究乳腺癌MCF-7細(xì)胞輻射敏感性的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI 1640培養(yǎng)基（購(gòu)自Gibco公司）；胰酶（購(gòu)自Am-resco公司）；小牛血清（杭州四季青產(chǎn)品）；槲皮素（購(gòu)自Gibco）；BSA（購(gòu)自 Roche 公司）；Triton X100（購(gòu)自 Amersharm 公司）；乙醇、Tris堿和氯化鈉（均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)）。MTT、Giemsa染劑（美國(guó) Sigma，華美分裝）；SDS、HEPES（購(gòu)自華美生物工程公司）。倒置相差顯微鏡 OLYMPUS CK40；THERMO FORMA3111 CO2培養(yǎng)箱；光學(xué)顯微鏡OLYMPUS CK40；酶標(biāo)儀BIO-TEK；流式細(xì)胞儀 BECKMANCOULTERFC500；血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、96孔板等。

1.2 方法

1.2.1 照射條件 采用西門(mén)子PRIMUS型醫(yī)用電子直線加速器產(chǎn)生的6 mV高能X射線照射，照射劑量率為300 cGy/min，源皮距為100 cm，加1 cm厚度組織補(bǔ)償物。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理?xiàng)l件 MCF-7細(xì)胞采用RPMI 1640培養(yǎng)基加10%的小牛血清在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按處理方式的不同，隨機(jī)分為A、B兩組，A組42℃熱休克處理2 h，誘導(dǎo)熱休克蛋白表達(dá)，B組熱處理前1 h加入終濃度為 50、100、150 μmol/L的槲皮素， 然后 42℃熱休克處理 2 h。 4 h 后分別用 X 射線 0、2、4、6、8、10、15 Gy輻照后繼續(xù)培養(yǎng)，用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，消化稀釋?zhuān)霉鈱W(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)儀進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞濃度，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，然后接種96孔板，每孔 100 μl，置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h。 經(jīng) A、B 組處理?xiàng)l件處理后，分別繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，棄培養(yǎng)基，PBS洗2次，每孔加入培養(yǎng)基 100 μl，MTT 10 μl（5 g/L），4 h 后除去培養(yǎng)基，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）100 μl，振蕩后在酶標(biāo)儀上570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值D，設(shè)置6個(gè)平行樣，并設(shè)空白對(duì)照。分別計(jì)算槲皮素對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制率。增殖抑制率=[1-（DB-D空白）/（DA-D空白）]×100%。

1.2.4 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按照射劑量大小將不同密度的細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，均勻分布。隨著照射劑量的增大，相應(yīng)增加接種的細(xì)胞數(shù)。 在照射劑量為 0、2、4、6、8、10 和 15 Gy時(shí)，密度分別為 500、500、2000、6000、10000、40000 和 80000個(gè)/5 ml。每組每個(gè)劑量點(diǎn)設(shè)三個(gè)平行樣，待細(xì)胞貼壁后，經(jīng)A、B組處理?xiàng)l件處理后，8 h后換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)10 d。PBS清洗兩遍，甲醇固定 15 min，Gimsa 應(yīng)用液（1∶9 PBS 液稀釋?zhuān)┤旧?0 min，計(jì)數(shù)50個(gè)以上細(xì)胞數(shù)的克隆團(tuán)。根據(jù)公式：細(xì)胞存活率SF（%）=B組克隆形成數(shù)/（接種細(xì)胞數(shù)×A組克隆形成率）×100%，求得各個(gè)時(shí)間劑量點(diǎn)存活分?jǐn)?shù)，繪制出各時(shí)間組細(xì)胞存活曲線。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV/PI雙標(biāo)法測(cè)定細(xì)胞凋亡率 取經(jīng)A、B組處理?xiàng)l件處理后的MCF-7細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI雙標(biāo)法來(lái)測(cè)定細(xì)胞凋亡。由于克隆實(shí)驗(yàn)表明槲皮素對(duì)X射線照射有增敏作用，且有濃度依賴(lài)關(guān)系。因此B組細(xì)胞在熱處理前選用比較有代表性的150 μmol/L槲皮素處理，然后X射線照射。兩組細(xì)胞再培養(yǎng)24 h，用0.25%胰酶消化液制成細(xì)胞懸液，用PBS離心洗2次，加入100 μl Binding Buffer 和 FITC 標(biāo)記的 Annexin-V （20 μg/ml）10 μl，室溫避光反應(yīng) 30 min，再加入 PI（50 μg/ml）5 μl，避光反應(yīng)5 min后，加入 400 μl Binding Buffer，立即進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上，采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)不同濃度槲皮素對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞輻射敏感性的影響

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，用終濃度為50、100、150 μmol/L的槲皮素作用于MCF-7細(xì)胞，可以檢測(cè)到在0～8 Gy劑量照射下，B 組（50、100、150 μmol/L）與 A 組不同濃度下槲皮素對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖抑制率的比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），并存在濃度依賴(lài)關(guān)系。10、15 Gy劑量照射時(shí)，B組（100、150 μmol/L）與 A 組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 見(jiàn)表1。

表1 不同濃度槲皮素對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞輻射敏感性的影響（±s，%）

表1 不同濃度槲皮素對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞輻射敏感性的影響（±s，%）

注：與A組比較，△P<0.05

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2.2 克隆形成實(shí)驗(yàn)觀測(cè)不同濃度槲皮素處理后MCF-7細(xì)胞的存活率

MCF-7細(xì)胞克隆形態(tài)學(xué)觀察，以50個(gè)以上的細(xì)胞組成為克隆形成的標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng) 0、50、100、150 μmol/L 不同濃度槲皮素處理后，X射線照射結(jié)果表明，不同濃度的槲皮素處理后，細(xì)胞的存活率存在差異，且在實(shí)驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)，有一定的濃度依賴(lài)關(guān)系，濃度越大，對(duì)X射線的增敏作用越強(qiáng)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)圖1。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度槲皮素處理方式下MCF-7細(xì)胞的凋亡率

經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，不加槲皮素處理的A組的MCF-7細(xì)胞經(jīng) 0、2、4、6、8、10 Gy 射線照射后的凋亡率分別為（2.31±0.62）%、（10.84±1.37）%、（14.32±0.91）%、（21.68±0.43）%、（28.87±1.02）%和（35.13±0.98）%。處理前加入槲皮素的 B組（150 μmol/L）經(jīng)X 射線照射后的凋亡率分別為（9.87±0.56）%、（17.69±1.63）%、（22.75±0.49）%、（30.16±2.23）%、（41.21±1.30）%和（48.83±1.52）%，A 組和 B 組（150 μmol/L）凋亡率比較，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

圖1 不同濃度槲皮素處理后照射MCF-7細(xì)胞存活率

3 討論

槲皮素（Quercetin，Que）是一種黃酮類(lèi)化合物，化學(xué)名為3，3′，4′，5，7-五羥基黃酮， 廣泛分布于自然界各種植物的花、葉、果實(shí)之中，具有多種生物活性及藥理作用，如擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，降低毛細(xì)血管通透性和脆性，抗血小板聚集，抗病毒，抗過(guò)敏，鎮(zhèn)痛，抗氧化，清除自由基，抗腫瘤等[3]。國(guó)內(nèi)外大量研究證實(shí)，槲皮素對(duì)前列腺癌、白血病、鼻咽癌、肝癌、胃癌及視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤等[4-6]多種腫瘤細(xì)胞有抑制增殖的作用，是頗具應(yīng)用前景的抗癌藥物之一。現(xiàn)在研究顯示槲皮素的抗癌機(jī)制主要有：①直接清除活性氧自由基、抑制脂質(zhì)氧化損傷：槲皮素對(duì)超氧陰離子（O2-）、羥自由基（-OH）和單線態(tài)氧均有良好的清除作用，其量效關(guān)系明顯[7]。②抑制腫瘤細(xì)胞增殖：惡性腫瘤細(xì)胞的周期調(diào)節(jié)失控，細(xì)胞分化受阻，使腫瘤細(xì)胞呈過(guò)度增殖狀態(tài)，因此調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞周期是槲皮素抗腫瘤作用的機(jī)制之一。槲皮素可將腫瘤細(xì)胞阻斷在G0/G1、G1/S或G2/M等細(xì)胞的各個(gè)時(shí)期[3]。③誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：槲皮素能激活蛋白激酶A、蛋白激酶G，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高，從而誘發(fā)凋亡[8]。④對(duì)熱休克蛋白和熱休克因子的影響：曾文鋌等[5]利用槲皮素抑制熱休克誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞熱休克蛋白70（HSP70）的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)槲皮素可以在轉(zhuǎn)錄水平上抑制HSP70的表達(dá)。⑤參與腫瘤相關(guān)基因的調(diào)控：槲皮素可以下調(diào)癌基因（如AKT、C-MYC）、上調(diào)抑癌基因（如P21、P300、P53）而產(chǎn)生抗腫瘤作用[9-10]。⑥逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥機(jī)制：槲皮素作為一種廣泛的ATP酶抑制劑，可競(jìng)爭(zhēng)抑制PgpNBD部分的ATP酶活性，從而抑制Pgp的藥物泵功能，發(fā)揮多耐藥功能[11]。

本研究主要是利用熱休克作用誘導(dǎo)熱休克蛋白表達(dá)，并用槲皮素抑制熱休克表達(dá)來(lái)研究槲皮素對(duì)MCF-7細(xì)胞輻射敏感性的影響。結(jié)果顯示，無(wú)論是MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率，還是流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，都說(shuō)明槲皮素可以對(duì)電離輻射起到一定的增敏作用，且在50～150 μmol/L濃度范圍內(nèi)有濃度依賴(lài)關(guān)系，濃度越大，增敏作用越強(qiáng)，可能與槲皮素抑制熱休克蛋白表達(dá)有關(guān)，也可能與槲皮素直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在照射劑量在2～10 Gy時(shí)，槲皮素可以檢測(cè)到其增敏作用，但15 GyX射線照射時(shí)，槲皮素對(duì)MCF-7細(xì)胞輻射敏感性的作用與A組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?？赡茉?yàn)閯┝刻?，掩蓋了這種增敏作用。

綜上所述，槲皮素對(duì)熱休克蛋白高表達(dá)影響凋亡的腫瘤細(xì)胞，槲皮素可以通過(guò)抑制熱休克蛋白在蛋白和轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，可見(jiàn)槲皮素在臨床上有很大的應(yīng)用價(jià)值。通過(guò)應(yīng)用槲皮素，既可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡產(chǎn)生治療作用，又可打破熱耐受，起到放、化療增敏作用。因此，研究槲皮素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制，對(duì)于預(yù)防和治療一些危害人類(lèi)健康的重大疾病具有非常重大的理論和實(shí)際意義。

[1]牛曉閣,汪森明,丁為民,等.Apogossypolone抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[J].腫瘤,2010,30(12):1022.

[2]王艷芳,王新華,朱宇同.槲皮素藥理作用研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2003,15(2):171-173.

[3]Hollman CP,Katan BM.Dietary flavonoids:intake,health effects and bioava ilability[J].Food Chem Toxicol,1999,37(9-10):937-942.

[4]于利人,張東昌,王瑞珉,等.槲皮素誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡機(jī)制探討[J].中國(guó)腫瘤臨床,2005,32(9):505-507.

[5]曾文鋌,唐武兵,馬佩球,等.槲皮素抑制熱休克誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞HSP70的表達(dá)[J].中華現(xiàn)代中西醫(yī)雜志,2004,2(11):969.

[6]金念祖,茅力,朱燕萍,等.槲皮素對(duì)人肺癌細(xì)胞和小鼠Lewis肺癌移植瘤細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制探討[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào),2005,18(2):125-128.

[7]Zielinska M.Antioxidative activity of flavonoids in stimulated human neutrophils[J].Filia Histochem Cytobiol,2003,38(1):25-31.

[8]Nursal TZ,Yildirim S,Noyan T,et al.Hemobilia and jaundice caused by acalculous cholecystitis[J].J Clin Gastroenterol,2002,34(2):191-192.

[9]Ong CS, Tran E, Nguyen TT, et al. Quercetin-induced growth inhibition and cell death in nasopharyngeal carcinoma cells are associated with increase in bad and hypophosphorylated retinoblastoma expressions [J].Oncol Rep,2004,11(3):727-733.

[10]Nair HK,Rao KV,Aalinkeel R,et al.Inhibition of prostate cancer cell colony formation by the flavonoid quercetin correlates with modulation of specific regulatory genes[J].Clin Diagn Lab Immunol,2004,11(1):63-69.

[11]YoshiharuM,Hitomi T,MatsuoH, et al. Effect of bioflavonoids on vincristine transport across blood-brain barrier [J]. Eur J Pharmacol,2000,395(3):193-201.