曹譯心 ，張 旭 ，張翠薇 ，何 穎 ，馬躍榮

1.瀘州醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，四川瀘州 646000；2.瀘州醫(yī)學(xué)院病理教研室，四川瀘州 646000；3.瀘州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥學(xué)實驗室，四川瀘州 646000

腎臟缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）是常見的臨床疾病，可導(dǎo)致急性腎功能衰竭。紅花是治療慢性腎臟疾病常用的活血化瘀藥物，有一定的臨床療效，但在IRI方面尚無研究。本研究建立IRI大鼠模型并利用紅花提取物進行干預(yù)，旨在觀察紅花提取物是否對IRI具有保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

動物為清潔級、健康9周齡SD大鼠，雌雄不拘，體重180～220 g，均由瀘州醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。

1.2 主要試劑

紅花注射液（主要成分：紅花黃色素、紅花醌苷、紅花素、新紅花苷，20 ml/支；十堰麥克制藥有限公司）。大鼠血肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）試劑盒（購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、內(nèi)皮素-1（ET-1）放免試劑盒（購自北京經(jīng)緯博恒生物科技開發(fā)有限公司）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和血丙二醛（MDA）檢測試劑盒（南京建成生物醫(yī)學(xué)公司）。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組 將40只大鼠隨機分為4組（每組各10只）：缺血再灌注組（陽性對照組）、假手術(shù)組（陰性對照組）、紅花低劑量干預(yù)組和紅花高劑量干預(yù)組。按照文獻[1]的方法處理如下：均以戊巴比妥鈉（5 mg/kg）腹腔麻醉，腹部正中切口，暴露雙側(cè)腎，之后各組分別處理如下，①缺血再灌注組，缺血前10 min，腎靜脈給予等容積生理鹽水，夾閉雙側(cè)腎動脈，60min后去除動脈夾，同法再給生理鹽水，縫合切口。24 h后各組大鼠以1.5%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔麻醉后，腹部正中切開，于下腔靜脈采血；同時取雙腎。②假手術(shù)組，不夾閉雙側(cè)腎動脈，不給生理鹽水，其余同缺血再灌注組。③紅花低劑量干預(yù)組和紅花高劑量干預(yù)組分別以10 ml/kg和20 ml/kg的紅花注射液代替生理鹽水，其余同缺血再灌注組。

1.3.2 檢測方法 采集的血液經(jīng)離心后取血清按試劑盒方法分別測定Scr、BUN和MDA的的含量。取一側(cè)腎按其重量加生理鹽水制成10%的組織勻漿，按試劑盒方法測定SOD，同時用放免法測定腎組織ET-1含量。取另一側(cè)腎進行石蠟切片行HE染色。

1.3.3 腎臟的病理學(xué)觀察 腎組織以中性緩沖甲醛固定，石蠟包埋，切成4 μm厚的切片，行HE染色，用普通光學(xué)顯微鏡檢查。觀察腎缺血再灌注后腎小球、腎小管充血、變性、壞死及白細胞浸潤等病理變化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎功能指標的變化

假手術(shù)組Scr及BUN含量均低于其他各組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；缺血再灌注組和紅花低劑量干預(yù)組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；但紅花高劑量干預(yù)組明顯低于缺血再灌注組和和紅花低劑量干預(yù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 見表1。

表1 各組大鼠Scr和BUN的變化（±s）

表1 各組大鼠Scr和BUN的變化（±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與缺血再灌注組和紅花低劑量干預(yù)組比較，bP＜0.05

組別 例數(shù)10101010假手術(shù)組缺血再灌注組紅花低劑量干預(yù)組紅花高劑量干預(yù)組Scr（μmol/L）85.59±11.37722.44±77.02a 673.06±102.59a 485.57±77.90ab BUN（mmol/L）6.74±1.0249.54±3.39a 45.11±6.74a 34.05±4.04ab

2.2 ET-1、SOD和MDA檢測

ET-1的含量水平，假手術(shù)組均低于其他各組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；缺血再灌注組和紅花低劑量干預(yù)組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；紅花高劑量干預(yù)組明顯低于缺血再灌注組和和紅花低劑量干預(yù)組 （P＜0.05）。SOD的含量水平，假手術(shù)組均高于其他各組（P＜0.01）；紅花低劑量干預(yù)組和紅花高劑量干預(yù)組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但二者都同時高于缺血再灌注組（P＜0.05）。MDA的含量水平，假手術(shù)組均低于其他各組（P＜0.01）；紅花低劑量干預(yù)組和紅花高劑量干預(yù)組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但二者都同時低于缺血再灌注組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠ET-1、SOD和血MDA的變化（±s）

表2 各組大鼠ET-1、SOD和血MDA的變化（±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與缺血再灌注組和紅花低劑量干預(yù)組比較，bP＜0.05；與缺血再灌注組比較，cP＜0.05

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2.3 病理組織學(xué)改變

除假手術(shù)組外，各組均出現(xiàn)不同程度的腎小球毛細血管擴張充血，腎小球囊腔擴張，腎小管上皮細胞空泡樣變性，近曲小管管壁腫脹，管腔變小及少量炎癥細胞浸潤。其中，以缺血再灌注組最重，甚至還出現(xiàn)腎小管上皮細胞顆粒樣變以及明顯的腎小管壞死、管腔堵塞和刷狀緣脫落。此外，腎小管腔可見炎癥細胞和蛋白管型，而紅花高劑量干預(yù)組最輕。見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理學(xué)改變（HE染色，×400）

3 討論

IRI屬急性腎損傷的范疇，在臨床上十分常見，但目前尚無有效的防治方法。IRI所致的急性腎功能衰竭在臨床較為常見，IRI系氧自由基引起的微循環(huán)血流障礙以及由細胞因子介導(dǎo)的對內(nèi)皮細胞及實質(zhì)細胞的免疫損傷。缺血期間，首先造成器官的ATP儲備衰竭，繼而通過無氧代謝提供能量，表現(xiàn)為糖酵解增加。灌注早期，大量注入的血氧一時不能充分利用，作為各種氧化酶的底物而產(chǎn)生氧自由基。再灌注時往往存在紅細胞外滲，同時紅細胞又易受到氧自由基的攻擊，出現(xiàn)形態(tài)改變和聚積，導(dǎo)致血液黏度增加，紅細胞溶解，進而產(chǎn)生大量血紅蛋白。血紅蛋白通過損傷脂質(zhì)雙分子層、細胞骨架、細胞代謝酶及DNA，并促進氧自由基產(chǎn)生，從而加重內(nèi)皮細胞損傷[2]。本研究結(jié)果顯示缺血再灌注后大鼠的Scr和BUN顯著上升，說明其腎功能顯著減退，表明IRI對腎功能影響顯著。

紅花屬菊科植物，其主要活性成分有紅花黃素、脂肪酸、黃酮醇類、紅花多糖、鏈烷雙醇、豆甾醇和紅花胺等。紅花有活血通經(jīng)、去瘀止痛的功能[3]。紅花提取物能抑制血小板聚集，降低血液黏度，其有效成分紅花黃色素能延長凝血酶原時間和凝血酶時間[4]。

SOD是廣泛存在于需氧物體內(nèi)的一種金屬酶，能催化超氧陰離子自由基產(chǎn)生歧化反應(yīng)，是體內(nèi)最為重要的自由基清除劑。可以歧化O2生成H2O2，從而保護細胞不受毒性氧自由基損傷[5]。MDA是機體內(nèi)氧自由基代謝中產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，它可以反映該體系中脂質(zhì)過氧化自由基的存在及反應(yīng)的程度，引發(fā)細胞膜大分子物質(zhì)（如蛋白、脂質(zhì)等）相互交聯(lián)、聚合，從而加重細胞膜變性和功能障礙[6]。

本實驗結(jié)果顯示相對假手術(shù)組，缺血再灌注組SOD含量顯著減少，MDA含量顯著升高，BUN、Scr明顯增加。表明缺血再灌注后，腎組織因為SOD的顯著減少，清除氧自由基的能力降低，導(dǎo)致腎結(jié)構(gòu)被破壞，同時功能下降。同時本實驗應(yīng)用紅花提取物干預(yù)缺血再灌注損傷過程，發(fā)現(xiàn)相對沒有使用紅花提取物干預(yù)的組分，干預(yù)組SOD含量較高，MDA含量明顯較低，而對應(yīng)的BUN、Scr明顯較低，說明紅花提取物可能能在一定程度上維持缺血性腎臟組織中的SOD活性，進而可以保持較高的氧自由基清除能力而起到保護腎臟的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)紅花提取物可以減輕IRI的程度，可改善相應(yīng)的腎功能。但其具體機制有待進一步研究。

[1]謝智慧,曹瑞,陳宗,等.高壓氧干預(yù)對大鼠腎缺血再灌注損傷保護作用的實驗研究[J].中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志,2010,32(2):98-101.

[2]梁鋼,黃巨恩,張肅,等.表沒食子兒茶素沒食子酸酯對腎缺血再灌注損傷的保護作用[J].中國藥理學(xué)通報,2003,19(1):97-100.

[3]郭曉鳳.中藥紅花的研究進展[J].中國民族民間醫(yī)藥,2008,17(2):73-74.

[4]賈菲菲,柴秋彥,賈俊.紅花黃色素B抗凝作用研究[J].山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2009,10(3):13-15.

[5]楊佳丹,董志,歐陽凈.兩維來司鈉對實驗性大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2007,32(6):578-580.

[6]Patel NS,Sharples EJ,Cuzzocrea S,et al.Pretreatment with EPO reduces the injury and dysfunction caused by ischemia/reperfusion in the mouse kidney in vivo[J].Kidney Int,2004,66(3):983-989.