吳高義 陳 磊 司武俊 王昭領(lǐng) 朱國(guó)雄

顳下頜關(guān)節(jié)病(temporomandibular disorders，TMD)病因復(fù)雜，與咬合、情緒等因素密切相關(guān)[1]。但因建模困難，指標(biāo)不易量化等原因，情緒因素與TMD的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，感覺(jué)神經(jīng)通過(guò)其末梢釋放神經(jīng)肽類物質(zhì)，與關(guān)節(jié)軟骨的代謝有密切的關(guān)系[2,3]，其中P物質(zhì)(substance P，SP)廣泛分布于TMJ中，在實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)下的TMJ病變的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[4]。因此，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用交流箱動(dòng)物模型，通過(guò)觀察情緒應(yīng)激后的大鼠TMJ內(nèi)SP的表達(dá)情況，進(jìn)一步了解情緒應(yīng)激與TMD關(guān)系。

1.材料及方法

1.1 材料 SD大鼠，三級(jí)，90只，體重120 g±20g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供編號(hào)SCXK(軍)2002-005，雌雄對(duì)半。

實(shí)驗(yàn)用大鼠交流箱(由第四軍醫(yī)大學(xué)教保中心制)，電刺激發(fā)生儀(由第四軍醫(yī)大學(xué)物理教研室提供，直流電刺激電壓48伏，刺激頻率0.5赫茲)，SP抗體(Sigma公司，美國(guó))，SABC試劑盒和DAB試劑盒(博士德生物工程有限公司，武漢)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 研究工具與測(cè)評(píng)方法見(jiàn)前文[5]。隨機(jī)將90只大鼠分為3組，每組各30只，分別為對(duì)照組，情緒應(yīng)激組(PS)和足部電擊組(FS)，各組動(dòng)物的體重、性別通過(guò)均衡檢驗(yàn)，證實(shí)無(wú)差異，具有可比性，動(dòng)物模型的制備和飼養(yǎng)條件相同。

施加刺激因素方法如下：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前一周，將大鼠都放入相應(yīng)的交流箱中適應(yīng)，不給任何刺激，使其適應(yīng)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，每天上午固定時(shí)間給與FS組電擊，每日30min，電壓48伏，應(yīng)激頻率0.5赫茲(圖1)，常規(guī)飼料喂養(yǎng)。

各組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法如下：(1)空白對(duì)照組：以無(wú)應(yīng)激狀態(tài)下飼養(yǎng)大鼠；(2)FS組：每天上午固定時(shí)間給與電擊，每日30min，電壓48伏，應(yīng)激頻率0.5赫茲；本組大鼠僅作為應(yīng)激原，不作為實(shí)驗(yàn)觀察對(duì)象。(3)PS組：通過(guò)FS組的排謝物，豎毛，尖叫等反應(yīng)受到心理影響。

圖1 情感交流箱示意圖

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 對(duì)照組、PS組動(dòng)物分別在1周、3周及5周時(shí)隨機(jī)選取10只取材，取材時(shí)用l0g/L戊巴比妥鈉(30mg／kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，經(jīng)左心室插管，先用10mL/L肝素生理鹽水沖洗血液，再用40g/L多聚甲醛灌流固定，取雙側(cè)TMJ，在40g/L多聚甲醛液中固定24小時(shí)。然后在8mol／L甲酸和1mol／L甲酸鈉等量混合的脫鈣液中脫鈣1周。流水沖24小時(shí)，常規(guī)脫水、透明、浸蠟包埋，4μm厚石蠟切片。分別行HE染色，SP免疫組織化學(xué)染色，灰度測(cè)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)處理 所有數(shù)據(jù)均采取均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)方法按照重復(fù)測(cè)量方差分析，采用SPPS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，以P＜0.05為差異顯著。

2.結(jié)果

2.1 大體觀察 實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)S組有尖叫，跳躍，翹尾，豎毛等行為表現(xiàn)；PS組有豎毛，恐慌等行為表現(xiàn)。取材時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組同性別大鼠平均體重相似，各組大鼠無(wú)意外死亡。

2.2 組織學(xué)表現(xiàn) 單視野中P物質(zhì)顯陽(yáng)性，主要分布在關(guān)節(jié)盤前、后帶，且多分布在近盤邊緣部，大多數(shù)陽(yáng)性纖維由棕黑色膨體呈串珠狀構(gòu)成。鏡下觀察PS 1周組陽(yáng)性纖維密度最高(圖3)。對(duì)照組(圖2)、PS3周組陽(yáng)性纖維密度較高(圖4)、PS5周組陽(yáng)性纖維密度較低(圖5)，但各組間差異不明顯。

圖2 對(duì)照組關(guān)節(jié)盤的P物質(zhì)染色(×100)

圖3 情緒應(yīng)激1周組關(guān)節(jié)盤的P物質(zhì)染色(×100)

圖4 情緒應(yīng)激3周組關(guān)節(jié)盤的P物質(zhì)染色(×100)

圖5 情緒應(yīng)激5周組關(guān)節(jié)盤的P物質(zhì)染色(×100)

2.3 HE染色(圖6) 對(duì)照組大鼠髁狀突軟骨由淺入深依次分為關(guān)節(jié)表面帶、增殖帶、纖維軟骨帶和鈣化軟骨帶。表面帶由與關(guān)節(jié)面平行的膠原纖維組成；增殖帶為許多密集的小細(xì)胞，即前軟骨細(xì)胞組成；纖維軟骨帶由圓形軟骨細(xì)胞組成。關(guān)節(jié)盤中央部分較薄，前后部分較厚，主要由纖維及軟骨成分組成。PS組1周組可見(jiàn)大鼠顳下頜關(guān)節(jié)下腔可見(jiàn)到明顯的脫落細(xì)胞，主要為滑膜細(xì)胞，髁突表面部分區(qū)域凹凸不平，表面膠原纖維水腫、松解。關(guān)節(jié)盤炎性反應(yīng)明顯，PS組3周時(shí)病理性變化最為明顯，關(guān)節(jié)盤后帶出現(xiàn)纖維玻璃樣變、斷裂，嚴(yán)重區(qū)部形成裂隙，PS組5周時(shí)，髁突表面部分區(qū)域凹凸不平，表面膠原纖維水腫、松解。

圖6 對(duì)照組，情緒應(yīng)激1、3、5周組大鼠顳頜關(guān)節(jié)HE染色)(×40)

2.4 圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn) 圖像分析表明，P物質(zhì)陽(yáng)性纖維與對(duì)照組比較，有顯著性差異(P＜0.01)。對(duì)照組和PS1周組之間有顯著性差異(P＜0.05)，對(duì)照組和PS3周組、5周組之間差異不顯著(P＞0.05)。PS3周組、5周組比較1周有下降趨勢(shì)，但仍然高于對(duì)照組(圖7)。

圖7 SP陽(yáng)性纖維灰度測(cè)量標(biāo)記圖

3.討論

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，情緒因素(心理社會(huì)因素)與TMD的發(fā)生，發(fā)展和治療效果有著密切的關(guān)系，甚至越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為TMD是一種心身疾病。學(xué)者們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)[6,7]，情緒因素如高水平應(yīng)激、軀體不適、情緒障礙等在TMD的發(fā)病過(guò)程中扮演了重要的角色。本研究結(jié)果證實(shí)情緒因素對(duì)TMJ的微結(jié)構(gòu)具有一定影響。

P物質(zhì)與TMJ關(guān)系密切，TMJ關(guān)節(jié)囊、盤、盤周附著、滑膜及骨膜中均有P物質(zhì)陽(yáng)性纖維的分布[8]。P物質(zhì)具有免疫調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)肥大細(xì)胞脫落，釋放組胺及5羥色胺等各種傷害性刺激因子，如創(chuàng)傷、壓力、精神緊張和炎癥介質(zhì)等，可能在骨組織重建以及骨折愈合過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用。在感受力學(xué)刺激和局部代謝狀況與調(diào)節(jié)靶細(xì)胞(成骨、破骨細(xì)胞)功能之間起著聯(lián)絡(luò)作用[4]。P物質(zhì)能夠誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞中DNA和蛋白質(zhì)的合成與分裂，促進(jìn)滑膜細(xì)胞增生形成滑膜翳，導(dǎo)致關(guān)節(jié)表面滑膜組織過(guò)分生長(zhǎng)，并與已知的滑膜細(xì)胞的另兩種刺激因子白細(xì)胞介素-1和腫瘤壞死因子相互作用，共同發(fā)揮對(duì)滑膜細(xì)胞的作用。在病理刺激下P物質(zhì)不僅順行傳入中樞表達(dá)痛覺(jué)信息等，而且被逆行釋放于局部組織中引起無(wú)菌性炎癥反應(yīng)，其濃度的高低與患者的疼痛密切相關(guān)[9]。本研究結(jié)果說(shuō)明大鼠TMJ在情緒應(yīng)激狀態(tài)下發(fā)生的一系列病理性改變中，P物質(zhì)神經(jīng)肽可能參與了這種病理過(guò)程，并且在病變的初期可以出現(xiàn)明顯的疼痛癥狀，而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，疼痛癥狀可能會(huì)有所減輕。

在臨床中我們有時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)，有些患者疼痛癥狀并不嚴(yán)重，但是，在關(guān)節(jié)鏡下我們可以看到TMJ有明顯的炎性組織存在，再也正好與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。所以，對(duì)TMJ病的治療，我們?cè)谒幬镏委熀褪中g(shù)治療的同時(shí)，更應(yīng)從機(jī)體功能紊亂和心理疾病兩方面因素對(duì)TMD進(jìn)行評(píng)估[10,11]。

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