馬軍利 顧 斌 王冠超 鄂玲玲 劉洪臣

乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，AchE)是一種具有乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)降解活性的酶，廣泛分布于骨骼肌、中樞、外周神經系統(tǒng)、以及膽堿能神經元支配的內、外分泌腺、平滑肌、心肌等組織，大量聚集于神經肌肉接頭，是神經肌肉接頭重要組成部分。神經沖動刺激神經末梢釋放大量的Ach，與突觸后nAch受體結合，引發(fā)肌細胞的去極化與肌肉收縮，而多余的Ach由乙酰膽堿酯酶將其水解，阻止Ach對肌纖維的持續(xù)興奮作用，保證突觸傳遞與肌肉活動的精確性。我們以往的研究表明大鼠咀嚼形成過程中Ach受體種類、數量均發(fā)生變化，并且粉食喂養(yǎng)對這一變化產生影響[1]，而對AchE在咀嚼形成過程中的表達變化及咬合功能負荷對其影響尚不清楚，本實驗利用酶組織化學染色方法，對大鼠離乳后咬肌AchE的變化進行初步研究。

1.材料和方法

1.1 動物分組與取材

選擇出生后18d的雄性SD大鼠(軍事醫(yī)學科學院動物試驗中心)40只，按照完全隨機實驗設計，將大鼠分為固體組、粉食組，每組20只。分別喂養(yǎng)標準顆粒狀固體鼠糧與粉狀鼠糧(北京科澳協(xié)力飼料有限責任公司)，兩種鼠糧營養(yǎng)成分相同。在大鼠3、4、6、9周齡時處死，每次粉、固體組各5只，烏拉坦麻醉后取表層咬肌，迅速置于液氮備用，以恒冷切片機作連續(xù)縱行冰凍切片備用，片厚10μm。

1.2 乙酰膽堿酯酶染色(Karnovsky-Roots法)

乙酰膽堿酯酶染色采用Karnovsky-Roots法，先于染色前半小時配置孵育液(將碘化乙酰硫代膽堿5mg溶于0.1M醋酸鈉緩沖液6.5ml，攪拌，依次加入0.1M檸檬酸鈉0.5ml，30mM硫酸銅1ml，蒸餾水1ml，5mM鐵氰化鉀1ml)，要求孵育液呈清亮綠色，PH值控制在6左右。將所有待測切片取出后風干30min，之后4%甲醛鈣固定30sec，流水沖洗10sec，將組織周圍液體擦去，置于濕盒，滴加加孵育液，置于37℃孵箱1h，鏡下觀察染色程度，呈淡棕色時流水沖洗5min，同時終止所有待測切片孵育，蒸餾水沖洗后二甲苯透明、甘油明膠封片。

1.3 圖像分析及統(tǒng)計

每個標本均選取連續(xù)5張切片，每張切片取5個視野，利用Image-pro plus 5.1圖象分析軟件(Media Cybernetics，Inc，USA)分析 AchE 平均光密度值(mean optical density，mOD)，利用SPSS 12.0進行雙因素方差分析與t檢驗，對時間因素與食物因素對mOD的影響進行分析，結果以均數±標準差形式表達()，p＜0.05視為有顯著性統(tǒng)計差異。

2.結果

光鏡下，咬肌運動終板AchE染色呈棕黃色至棕褐色的橢圓外形，運動終板集中分布，形成終板帶，見圖1。

圖1 大鼠4周時咬肌運動終板AchE染色(Karnovsky-Roots法，H＆E復染)，A：終板帶，100×；B：局部放大，200×

標準固體飲食組大鼠在出生后3-9wAchE強度呈逐漸上升趨勢，其中出生后4w、6w的AchE含量較3w分別增加了7.53%與9.83%，與3周有明顯差異(p＜0.05)，見圖2。

在粉狀食物喂養(yǎng)下，大鼠咬肌AchE強度呈現與固體組相似的變化趨勢，3w到6w均逐漸上升，明顯強于3w時水平，9w表達有所下降，與3w時沒有顯著差異。方差分析顯示，兩種食物對于3-9w大鼠咬肌的AchE含量的影響不具統(tǒng)計意義(p＞ 0.05)，見圖 2。

圖2 大鼠咬肌AchE含量在發(fā)育中的變化，*p＜0.05，各組與3周時相比。

3.討論

以往對咀嚼形成過程中咀嚼中樞神經元、咀嚼肌肌纖維功能、形態(tài)變化的研究較多，采用的動物模型有拔牙、咬合抬高等[2]，這些模型均具有一定創(chuàng)傷性，本研對大鼠喂養(yǎng)粉狀鼠糧，造成咬肌功能負荷下降，完全無創(chuàng)，避免了創(chuàng)傷對結果的影響，并且對大鼠體重無顯著影響。AchE染色采用經典的Karnovsky-Roots法，通過乙酰膽堿酯酶水解碘化乙酰硫代膽堿，產生硫代膽堿，硫代膽堿含有硫氫基，可以把鐵氰化鉀還原為亞鐵氰化鉀，同離子結合后形成棕褐色的亞鐵氰化銅，在酶活性區(qū)沉淀，其染色深淺與AchE含量有關，從而反映突觸活動的變化[3]。

大鼠在出生后3-4周開始形成咀嚼，4w后基本已經形成成熟的咀嚼模式，大鼠下頜運動的形式、幅度，咀嚼肌負荷均與之前的吮吸階段有著顯著差異，反映了咀嚼中樞傳出沖動的形成與變化[4]，引發(fā)三叉神經運動支末梢釋放Ach，與運動終板的Ach受體結合，引起咬肌的收縮。在生理狀態(tài)下，每次神經沖動都會釋放大量的Ach，遠超過運動終板Ach受體結合所需，多余的Ach將由AchE迅速水解，避免肌肉的持續(xù)去極化與收縮[5]。正是由于AchE與突觸傳遞的這種密切關系，AchE含量的變化可以在一定程度上反映突觸活動的變化。Pregelj等[6]利用后肢懸吊實驗造成大鼠比目魚肌負荷的下降，發(fā)現AchE mRNA顯著下降，而負荷增加可以顯著增加AchE mRNA表達。AchE這種對于功能變化的敏感性與年齡有關，Boudreau-Lariviere[7]等發(fā)現去神經支配可以迅速引起成年大鼠肌肉AchE mRNA表達大幅的下降，而幼鼠下降的幅度明顯低于成年鼠，說明成年大鼠肌肉對于失神經支配更為敏感；除此之外，不同肌纖維類型中的AchE對功能變化的敏感性也不同，例如在慢肌AchE含量只是快肌含量的30%，在懸吊實驗8天后，慢肌的AchE并沒有大的變化，而快肌則下降到對照的80%左右[8]，說明快肌纖維AchE含量對負荷降低更為敏感。不同亞型的AchE敏感性也不同，G4型表達對對功能變化敏感，而不對稱型AchE則不敏感[9]。

在本研究中，出生后3至6w大鼠咬肌AchE表達顯著上升，此階段是大鼠咀嚼形成時期，咀嚼活動的增加、功能負荷的增強引起AchE表達的增加，但粉食喂養(yǎng)引起的功能負荷降低未引起AchE的顯著變化，這可能與以下因素有關：(1)功能負荷下降的程度，粉食喂養(yǎng)沒有完全阻斷咬肌功能負荷，僅會導致咀嚼時間與咬肌負荷強度的下降[10]，其功能負荷下降程度較低；(2)大鼠年齡，本研究大鼠處于幼年發(fā)育過程中，這一階段對于功能負荷變化的敏感性弱于成熟期；(3)肌纖維類型，盡管我們以往研究表明，粉食喂養(yǎng)可以增加咬肌2b纖維比例，降低2a纖維比例，但二者均為快肌纖維，這造成粉、固食組大鼠咬肌AchE含量沒有大的差異；(4)可能與咬肌中AchE類型有關，咬肌中AchE組成、不對稱型AchE與G4型AchE的比例現仍不清楚，有待于進一步研究。

總之，幼年大鼠咬肌AchE表達對粉食喂養(yǎng)造成的功能負荷下降不敏感，可以保證運動終板部位有足量的AchE，確保不同功能活動下突觸傳遞的有效性與精確性，有利于個體咀嚼模式的建立與成熟，而完全性的阻斷咬肌功能活動對其有何影響仍有待于進一步研究。

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