王 洋，成志強(qiáng)，王曉玫，婁 楠

(1.深圳市人民醫(yī)院(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院)，廣東 深圳518020；2.香港大學(xué)深圳醫(yī)院)

黑色素瘤是起源于神經(jīng)嵴黑素細(xì)胞的具有高度侵襲性的惡性腫瘤，病變早期就可以侵及深部，發(fā)生局部淋巴結(jié)和/或血行轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。過度的紫外線照射是其明確的病因之一，嚴(yán)重威脅到戶外活動(dòng)較多的兒童及青少年人群，發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢[1,2]。惡性腫瘤的傳統(tǒng)治療方式是通過手術(shù)、放療和化療，但是由于黑色素瘤細(xì)胞顯示出高侵襲性、耐藥性和抗輻射性等特征，晚期患者傳統(tǒng)治療的效果并不理想[3]。隨著精準(zhǔn)治療理念的提出，在黑色素瘤分子分型研究中發(fā)現(xiàn)約50%的晚期患者存在BRAF(B Rapidly Accelerated Fibrosarcoma)基因突變[4]。針對BRAFV600E突變的抑制劑Vemurafenib，使部分晚期BRAF突變的黑色素瘤患者腫瘤進(jìn)程得到有效緩解，但該藥物易出現(xiàn)短期耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)的現(xiàn)象以及誘發(fā)皮膚鱗狀細(xì)胞癌、慢性淋巴細(xì)胞性白血病等不良后果不容忽視[5,6]。近年來在腫瘤免疫治療研究方面，美國FDA于2014-2015年間先后批準(zhǔn)PD-1(Programmed Death 1)的抑制劑Nivolumab，用于治療BRAFV600E突變的晚期不可切除的黑色素瘤患者；CTLA-4(Cytotoxic T- lymphocyte- associated Antigen 4)的抑制劑Ipilimumab，用于Ⅲ期黑色素瘤患者術(shù)后的輔助治療[7,8]。這些用于免疫治療的藥物使部分患者的腫瘤進(jìn)程得到有效控制，但同樣由于耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)的迅速產(chǎn)生，副作用的影響以及高額的費(fèi)用，臨床超過半數(shù)用藥有效的患者不得不選擇放棄治療[9,10]。目前晚期黑色素瘤患者短期迅速耐藥的難題亟待解決。

三氧化二砷(arsenic trioxide)早在2000多年前已被我國中醫(yī)藥領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，如今作為化療藥物，三氧化二砷已經(jīng)被成功應(yīng)用于白血病的治療中：研究表明砷化物可以誘導(dǎo)白血病中腫瘤細(xì)胞的分化，并促進(jìn)這類細(xì)胞自身發(fā)生凋亡[11]；此外三氧化二砷在其他一些實(shí)體腫瘤治療的實(shí)驗(yàn)研究和臨床療效方面，同樣取得了顯著的進(jìn)展，包括從體外細(xì)胞系研究，進(jìn)一步過渡到動(dòng)物體內(nèi)的移植瘤研究，再逐漸擴(kuò)展到臨床應(yīng)用，證明其在抗腫瘤這一艱巨且迫切的任務(wù)中擁有巨大治療潛力和廣闊的應(yīng)用前景[12-15]。結(jié)合目前黑色素瘤治療研究所遇到的困難，且三氧化二砷作用于黑色素瘤細(xì)胞的相關(guān)研究報(bào)道并不多見。因此本研究另辟蹊徑，擬對三氧化二砷作用于黑色素瘤細(xì)胞的效應(yīng)及相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行探討，可以為晚期黑色素瘤的臨床治療研究提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 相關(guān)材料試劑

小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16-F10來自于美國ATCC資源中心；H-DMEM培養(yǎng)基購自Gibico公司；胎牛血清購自杭州四季青生物公司；三氧化二砷購自于黑龍江哈爾濱醫(yī)大藥業(yè)股份有限公司；CCK8細(xì)胞活性檢測試劑盒、細(xì)胞周期檢測試劑盒及Annexin V-FITC/PI檢測試劑盒分別購買于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；提取RNA所用試劑購自于美國賽默飛公司；DNaseI(RNase free)購自于Promega Corporation；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及相關(guān)PCR引物均來自于寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；qPCR相關(guān)試劑購自愛普拜斯應(yīng)用生物系統(tǒng)貿(mào)易有限公司。

1.2 三氧化二砷對B16-F10細(xì)胞的處理

稀釋三氧化二砷儲(chǔ)存液，配置終濃度分別為：0 μM，5 μM，10 μM，20 μM，40 μM，80 μM的砷化物工作液。在37℃、5% CO2條件下，取細(xì)胞培養(yǎng)箱中用含10%FBS的H-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的指數(shù)增長期的B10-F10細(xì)胞，以2.0×105個(gè)/ml的細(xì)胞密度，接種于所需的6 cm培養(yǎng)皿中，或以2×103個(gè)細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的三氧化二砷溶液再繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以0 μM組為陰性對照，分別進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.3 三氧化二砷作用后B16-F10細(xì)胞增殖的檢測

劑量效應(yīng)曲線的繪制：取如1.2中所述0 μM，5 μM，10 μM，20 μM，40 μM，80 μM濃度三氧化二砷處理的細(xì)胞，分別加入CCK-8溶液(10 μl/孔)，于恒溫箱內(nèi)37℃孵育2 h，檢測OD490 nm吸光度數(shù)值，繪制三氧化二砷作用于B16-F10細(xì)胞的劑量效應(yīng)曲線。時(shí)間效應(yīng)曲線的繪制：另取如1.2中所述0 μM，5 μM濃度三氧化二砷處理的細(xì)胞，連續(xù)5 d進(jìn)行檢測，并繪制三氧化二砷作用于B16-F10細(xì)胞的時(shí)間效應(yīng)曲線。本實(shí)驗(yàn)所涉及計(jì)算公式：細(xì)胞存活率(%)=[實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對照組平均OD值]×100%；IC50=lg-1[Xm -i(Σp-0.5) ]，公式中Xm為設(shè)計(jì)的最大濃度的對數(shù)值；i代表相鄰兩組濃度對數(shù)值之差；Σp表示各組生長抑制率之和，(生長抑制率p (%)=[(對照組平均OD值-實(shí)驗(yàn)組平均OD值)/對照組平均OD值]×100%)；0.5為經(jīng)驗(yàn)常數(shù)。

1.4 三氧化二砷作用后B16-F10細(xì)胞凋亡的檢測

取如1.2中所述0 μM，5 μM濃度三氧化二砷處理的細(xì)胞，胰酶(不含EDTA)消化后收集細(xì)胞，分別加入Annexin V-FITC檢測溶液(5 μl/管)，避光，4℃孵育15 min后，再次加入PI檢測溶液(10 μl/管)，避光，4℃孵育，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。 其中設(shè)置對照組：Annexin V-FITC和PI均未添加組；只添加加Annexin V-FITC組；只添加PI組；Annexin V-FITC和PI全部添加組。

1.5 三氧化二砷作用后B16-F10細(xì)胞周期的檢測

1.6 qPCR檢測相關(guān)基因表達(dá)

取如1.2中所述0 μM，5 μM濃度三氧化二砷處理的細(xì)胞進(jìn)行RNA提取(Trizol);OD值的測定(分光光度計(jì))，計(jì)算RNA濃度[RNA濃度(ug/ul)=OD260×40×稀釋倍數(shù)]；運(yùn)用RT試劑進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄；PCR引物的選擇：小鼠RPL13作為內(nèi)參，上游序列：5’-CGA GTT GGC TGG AAG TAC C-3’，下游序列5’-CTT CTG GCC TGT TTC CGT AG-3’；小鼠STC1為目的基因，上游序列5’-CTT AAA GTG CAT CGC CAA TGG G-3’，下游序列5’-GCT TCG GAC AAG TCT GTT GTA-3’，運(yùn)用Sybe Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系(詳見試劑說明書)進(jìn)行qPCR反應(yīng)，獲得相應(yīng)的Ct值，通過2(-△△Ct)定量基因的表達(dá)(△Ct值=目的基因Ct值-內(nèi)參Ct值。△△Ct值=5 μM三氧化二砷處理△Ct值-0 μM三氧化二砷處理△Ct值)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 三氧化二砷抑制B16-F10細(xì)胞增殖

腫瘤的發(fā)生最直觀的體現(xiàn)就是生長失控，與腫瘤細(xì)胞異常增殖密切相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)不同濃度的三氧化二砷作用于B16-F10細(xì)胞后，細(xì)胞增殖程度均被不同程度的抑制，如圖1A所示，在5 μM的三氧化二砷作用下，細(xì)胞的增殖率明顯下降(P<0.05)，細(xì)胞增殖率隨著砷化物劑量的增加，下降越明顯；如圖1B所示，在5 μM的三氧化二砷作用24 h即可顯著降低細(xì)胞增殖率(P<0.05)，作用48 h對細(xì)胞增殖抑制更為顯著(P<0.01)，48 h后無顯著差別；如表1所示，計(jì)算IC50值=65.3±6.5 μM。這些結(jié)果表明三氧化二砷在較低濃度(5 μM)作用24 h就可以顯著抑制B16-F10細(xì)胞的增殖，且砷化物濃度與細(xì)胞增殖抑制程度呈劑量效應(yīng)關(guān)系。

圖1 三氧化二砷抑制B16-F10細(xì)胞增殖

注：A代表不同濃度三氧化二砷作用于B16-F10細(xì)胞的劑量效應(yīng)關(guān)系；B代表5 μM三氧化二砷作用于B16-F10細(xì)胞的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，*P<0.05，**P<0.01。

表1 三氧化二砷抑制B16-F10細(xì)胞增殖分析及IC50

注：*P<0.05，**P<0.01。

2.2 三氧化二砷促進(jìn)B16-F10細(xì)胞的凋亡

化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的重要機(jī)制之一就是誘發(fā)細(xì)胞凋亡。本研究同時(shí)檢測了三氧化二砷作用下B16-F10細(xì)胞的細(xì)胞凋亡情況。如圖2所示，我們發(fā)現(xiàn)在5 μM的三氧化二砷作用下，細(xì)胞的凋亡率顯著增加(P<0.05)；隨著砷化物劑量的增加，凋亡率增加越明顯；如表2所示，計(jì)算IC50值=70.4±3.6 μM。表明較低濃度(5 μM)的三氧化二砷可以顯著促進(jìn)B16-F10細(xì)胞的凋亡，且砷化物濃度與細(xì)胞凋亡程度呈劑量效應(yīng)關(guān)系。

表2 三氧化二砷促進(jìn)B16-F10細(xì)胞凋亡分析及IC50

注：*P<0.05，**P<0.01。

2.3 三氧化二砷阻斷細(xì)胞G1→S期進(jìn)程

為探尋三氧化二砷抑制細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，本研究繼續(xù)運(yùn)用利用流式細(xì)胞術(shù)，檢測三氧化二砷(5 μM)處理的B16-F10細(xì)胞周期的改變。結(jié)果如圖3所示，砷化物可以顯著減少S期的細(xì)胞數(shù)量， 并顯著增加G0/G1期細(xì)胞數(shù)量，如表3所示，細(xì)胞周期相關(guān)的SPF及PI明顯減低(P<0.05)。這些結(jié)果提示三氧化二砷是通過阻斷細(xì)胞G1→S期進(jìn)程，降低細(xì)胞增殖的活性。

圖2.2 三氧化二砷促進(jìn)B16-F10細(xì)胞凋亡

圖3 三氧化二砷阻斷B16-F10細(xì)胞G1→S期進(jìn)程

組別G0/G1SG2/MSPF(%)PI(%)未處理組72.84±1.415.92±1.211.24±1.315.92±1.127.16±1.55 μM砷處理組78.14±1.512.05±2.69.81±1.412.05±1.6*16.86±1.5*

注：*P<0.05。

2.4 三氧化二砷降低了B16-F10細(xì)胞STC1的mRNA水平

為進(jìn)一步探討三氧化二砷的作用機(jī)制，本研究檢測了砷化物作用下B16-F10細(xì)胞STC1的mRNA水平，如表4所示。在5 μM濃度的三氧化二砷作用下，斯鈣素1(Stanniocalcin-1，STC1)的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)，為對照組的42.51±5.62% (P<0.01)。該結(jié)果提示三氧化二砷對黑色素瘤細(xì)胞的作用機(jī)制可能與抑制了細(xì)胞內(nèi)STC1的mRNA水平，進(jìn)而阻斷了細(xì)胞G1→S期進(jìn)程，并引起細(xì)胞凋亡相關(guān)。

表4 STC1的mRNA表達(dá)的分析

注：**P<0.01。

3 討論

盡管晚期黑色素瘤的研究從分子分型到免疫治療等方面取得了重要進(jìn)展，在世界范圍內(nèi)發(fā)表的探索性科研成果日益增多，但目前患者短期內(nèi)耐藥復(fù)發(fā)的情況依然存在，尚缺乏安全有效的治療措施，其根本原因在于靶向殺傷黑色素瘤細(xì)胞的相關(guān)調(diào)控機(jī)制尚未清晰，制約了防治研究的進(jìn)程。

在從白血病到實(shí)體瘤的研究中表明三氧化二砷可以直接作用于線粒體，還能繞過線粒體上游的傳導(dǎo)階段，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]；砷化物還能直接作用于氧化還原酶，引起細(xì)胞內(nèi)活性氧含量增加，進(jìn)而抑制細(xì)胞有絲分裂，并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[15]；還可以抑制端粒酶活性誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[16]等等。但目前三氧化二砷對黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)生的效應(yīng)及分子機(jī)制的相關(guān)研究還并不多見。

本研究發(fā)現(xiàn)三氧化二砷在較低濃度(5 μM)作用24 h就可以顯著抑制B16-F10細(xì)胞的增殖，且砷化物濃度與細(xì)胞增殖抑制程度呈劑量效應(yīng)關(guān)系；同時(shí)較低濃度(5 μM)的三氧化二砷可以顯著促進(jìn)B16-F10細(xì)胞的凋亡，且砷化物濃度與細(xì)胞凋亡程度呈劑量效應(yīng)關(guān)系。上述兩部分結(jié)果共同提示黑色素瘤細(xì)胞對三氧化二砷具有較高的敏感性，砷化物在治療黑色素瘤方面頗具潛力。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，三氧化二砷(5 μM)可以顯著增加G0/G1期細(xì)胞數(shù)量，并明顯減低細(xì)胞周期相關(guān)的SPF及PI(P<0.05)。這些結(jié)果提示三氧化二砷是通過阻斷細(xì)胞G1→S期進(jìn)程，降低細(xì)胞增殖的活性；在三氧化二砷(5 μM)作用下，STC1的mRNA水平顯著下調(diào)，為對照組的42.51±5.62%(P<0.01)。STC1作為一種分泌型糖蛋白，通過抑制過氧化物生成，參與調(diào)節(jié)線粒體功能[17]。STC1在多種腫瘤細(xì)胞及其動(dòng)物模型中都具有促進(jìn)細(xì)胞增殖等作用，可以促進(jìn)細(xì)胞周期G1→S期進(jìn)程及減少細(xì)胞的凋亡[18,19]。由此可見，三氧化二砷對B16-F10細(xì)胞的作用機(jī)制是抑制細(xì)胞內(nèi)STC1的mRNA水平，阻斷了細(xì)胞G1→S期進(jìn)程，引起細(xì)胞凋亡。結(jié)合本研究的前期工作[12]，可以進(jìn)一步推斷在黑色素瘤中三氧化二砷通過抑制細(xì)胞內(nèi)STC1的mRNA水平，影響和改變氧化還原酶的活性，增加細(xì)胞內(nèi)的活性氧，阻斷了B16-F10細(xì)胞G1→S期進(jìn)程，引起細(xì)胞凋亡，更詳細(xì)的相關(guān)機(jī)制是本研究后續(xù)將要深入探討的部分。

綜上所述，三氧化二砷可以顯著抑制B16-F10細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，作為一種潛在的治療藥物，為晚期黑色素瘤的輔助治療提供新的思路；可能的作用機(jī)制是抑制細(xì)胞內(nèi)STC1的mRNA水平，阻斷了細(xì)胞G1→S期進(jìn)程，引起細(xì)胞凋亡，提示STC1可以作為黑色素瘤治療的靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步研究。