王興啟，劉 軒，楊麗華，于紅麗，翟 玥，劉 靜，姚瑞芹

(徐州醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，江蘇徐州 221002)

研究發(fā)現(xiàn)，缺血缺氧可以導(dǎo)致腦氧化損傷、興奮毒性損傷、炎癥反應(yīng)等并可能誘發(fā)腦室周圍白質(zhì)軟化?。?－2］(periventricular leukomalacia，PVL)。OPCs受損和神經(jīng)纖維脫髓鞘是PVL的最大特征。中樞神經(jīng)系統(tǒng)能夠通過誘導(dǎo)OPCs分化為成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞進行髓鞘再生。因此，保護和減少OPCs損傷是減緩 PVL發(fā)展的關(guān)鍵。槲皮素(quercetin，QUE)是一種天然黃酮類物質(zhì)，它們具有良好的促細(xì)胞增殖和細(xì)胞保護作用［3－4］。此外，槲皮素的多種神經(jīng)保護作用也得到研究證實［5－6］。因此它可能在抗OPCs損傷中有良好的效果。但槲皮素對OPCs缺氧低糖損傷的保護效果如何并未見相關(guān)報道。本研究將在Na2S2O4誘導(dǎo)的OPCs損傷模型基礎(chǔ)上探討槲皮素不同孵育方法對OPCs缺氧低糖損傷的保護效果。

1 材料與方法

1.1 材料新生1～2 d SD大鼠(♀♂不拘)，由徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號:SCXK(蘇)2005－0005;使用許可證號:SYXK(蘇)2005－0018;DMEM/F12(1∶1)、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子和重組人血小板衍化生長因子均購于Gibco公司;槲皮素購于Sigma公司;胎牛血清(FBS)購于杭州四季青生物工程材料有限公司;兔多克隆抗體A2B5購于武漢USCN SCIENCES公司;連二亞硫酸鈉購于南京博湃生物技術(shù)有限公司;CCK-8檢測試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒及Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)高純度OPCs分離、純化和培養(yǎng)，參照 Chen 等［7］的方法。

1.3 建立缺氧低糖損傷模型純化的OPCs培養(yǎng)3 d后棄去培養(yǎng)基，漂洗2次后加入含2 mmol·L－1Na2S2O4的低糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，旋緊瓶口，正常對照組仍用原來方法培養(yǎng)。Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測對照組、0.5 h組、1 h組和1.5 h組的細(xì)胞凋亡情況。

1.4 CCK-8法檢測細(xì)胞存活率檢測1～100 μmol·L－1槲皮素分別處理OPCs 12 h對其活性的影響。將純化的OPCs接種于96孔板中，分為6組，每組設(shè)5個復(fù)孔，每孔100 μl培養(yǎng)基，每天半量換液，3 d后分別在對照組及各槲皮素濃度組每孔中加入10 μl的CCK-8溶液繼續(xù)孵育4 h。槲皮素共孵育和預(yù)孵育比較實驗則分別設(shè)7組，即對照組、OGD組和1～81 μmol·L－1槲皮素組。酶聯(lián)儀檢測細(xì)胞D450值。細(xì)胞相對存活率=模型組D450值/正常對照組D450值。共孵育是指OPCs缺氧低糖損傷的同時各組加入相應(yīng)濃度的槲皮素，而預(yù)孵育是指各組用相應(yīng)濃度槲皮素預(yù)先孵育3 h后再行缺氧低糖損傷。損傷時間選擇1.5 h。

1.5 LDH漏出率測定分組方法同上，處理方法按照LDH測定試劑盒操作說明書進行。

1.6 槲皮素對OPCs缺氧低糖損傷形態(tài)學(xué)的影響將純化的OPCs接種于6孔板中，分為4組，即對照組、OGD 組、81 μmol·L－1槲皮素共孵育組和預(yù)孵育組。缺氧低糖損傷后分別在鏡下觀察各組在形態(tài)學(xué)上的改變。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件分析，組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，數(shù)據(jù)用±s表示。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度槲皮素對細(xì)胞活性影響采用不同濃度(1、3、9、27、81、100 μmol·L－1)的槲皮素處理OPCs 12 h后，測定每組細(xì)胞相對存活率。結(jié)果表明:當(dāng)其濃度達(dá)到 100 μmol·L－1時細(xì)胞活性受到明顯影響(P ＜ 0.01)。以上 1、3、9、27、81 μmol·L－1濃度被選用于后續(xù)實驗。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測OPCs凋亡情況對照組正常存活細(xì)胞相對數(shù)量為98.6±0.9，缺氧低糖0.5 h組為64.2±4.3(P＜0.01)，1 h組為21.5±4.8(P＜0.01)，1.5 h組為10.5±5.5(P＜ 0.01);凋亡細(xì)胞相對數(shù)量與對照組相比，缺氧低糖0.5 h組為35.1±7.6(P＜0.01)，1 h組為 76.8±17.2(P＜0.01)，1.5 h組為88.7±5.7(P ＜0.01)。見 Fig 1。

Fig 1 The proportion of apoptotic cells was determined by Annexin V-FITC/PI assay(n=3)

2.3 槲皮素對缺氧低糖損傷OPCs相對存活率和LDH漏出率的影響Fig 2表明:槲皮素能明顯提高OPCs的相對存活率，抵抗缺氧低糖損傷，F(xiàn)ig 3表明:槲皮素能明顯降低缺氧低糖損傷細(xì)胞LDH漏出率，間接反映槲皮素對OPCs細(xì)胞膜的保護作用。Fig 2，3都表明:同一濃度下共孵育的保護效果比預(yù)孵育更明顯(P＜0.05)，其發(fā)揮保護作用的濃度范圍分別是 3 ～81 μmol·L－1和 9 ～81 μmol·L－1，表現(xiàn)為劑量效應(yīng)。

Fig 2 Effect of QUE on the viability of OPCs was measured by CCK-8(n=4)

Fig 3 Effect of QUE on the LDH release of OPCs was measured by LDH assay(n=4)

2.4 槲皮素對OPCs缺氧低糖損傷形態(tài)學(xué)的影響81 μmol·L－1槲皮素處理 OPCs后，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。對照組細(xì)胞輪廓清晰，可見典型的雙極突起，橢圓形胞體邊緣有明顯光暈;缺氧低糖1.5 h后，OGD組的細(xì)胞突起全部回縮且?guī)缀醵计∑饋?，槲皮素預(yù)孵育組細(xì)胞胞體全部回縮但漂浮率較OGD組偏低，而共孵育組仍可見部分細(xì)胞有突起存在且漂浮率明顯偏低。見Fig 4。

3 討論

Fig 4 The morphology of OPCs was observed by inverted microscope

中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程OPCs在腦中遷移并最終分化為成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞形成髓鞘，髓鞘包裹著軸突并維持它的生理功能［8］。當(dāng)某些因素導(dǎo)致軸突脫髓鞘后會繼發(fā)多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，此時OPCs的修復(fù)作用對病情的好轉(zhuǎn)尤為重要。但是，OPCs抵抗損傷的能力有限特別是在妊娠期23～32周時缺血缺氧對其損傷尤為嚴(yán)重［9］。早產(chǎn)兒中患腦癱的比例比較大，這與OPCs損傷有很大關(guān)系。槲皮素具有良好的神經(jīng)保護作用，已有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠明顯降低皮質(zhì)細(xì)胞因缺氧缺糖導(dǎo)致的興奮毒性損傷［10］，此外，它還能保護大鼠因缺血而致的空間記憶減退和神經(jīng)細(xì)胞死亡［11］。本研究發(fā)現(xiàn)槲皮素對OPCs缺氧低糖損傷具有保護作用，這些數(shù)據(jù)進一步證明了它的神經(jīng)保護作用，也為OPCs損傷保護提供了良好的藥物選擇。

Na2S2O4可以迅速制造出無氧液相環(huán)境且自身不直接損傷細(xì)胞，其模型建立效果也已得到其他實驗證實［12－13］。我們選擇了1.5 h缺氧低糖損傷模型，探討 1 ～81 μmol·L－1槲皮素對 OPCs的保護作用。共孵育和預(yù)孵育的實驗結(jié)果都證明了槲皮素可以保護OPCs細(xì)胞膜的完整性并提高其相對存活率，形態(tài)學(xué)結(jié)果進一步反映了受保護細(xì)胞的存活狀況，當(dāng)細(xì)胞得到槲皮素的保護后其形態(tài)也得到一定程度的維護。同時，本實驗發(fā)現(xiàn)槲皮素共孵育的神經(jīng)保護作用較預(yù)孵育明顯，這可能與OPCs受損后其細(xì)胞膜通透性增加，共孵育時槲皮素進入受損細(xì)胞的濃度相對增加有關(guān)。此外，槲皮素的神經(jīng)保護作用表現(xiàn)出劑量效應(yīng)，這可能與隨濃度增加其進入細(xì)胞的相對濃度增加有關(guān)。

綜上，本研究證實了槲皮素對OPCs缺氧低糖損傷有明顯的神經(jīng)保護作用。這些數(shù)據(jù)為OPCs缺氧低糖損傷保護提供了初步的藥理學(xué)依據(jù)，也為深入研究槲皮素對OPCs神經(jīng)保護機制提供了藥物孵育方案。

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