趙東杰，王 峻，何炳榮

銀杏葉提取物對白介素-1β?lián)p傷關(guān)節(jié)軟骨細胞MMP-3和TIMP-1的影響

趙東杰，王 峻，何炳榮

目的：觀察銀杏葉提取物對白介素-1β?lián)p傷的關(guān)節(jié)軟骨細胞的作用及對MMP-3、TIMP-1的影響。方法：在無菌環(huán)境下消化得到3個月齡雌性新西蘭白兔膝關(guān)節(jié)軟骨細胞，用第2代軟骨細胞。軟骨細胞與IL-1β（5 μg/L）、IL-1β（5 μg/L）加地塞米松（10-6mmol/L）、IL-1β（5 μg/L）加銀杏葉提取物（40 mg、80 mg、160 mg/L）共同孵育，24 h后ELISA測定受損傷軟骨細胞培養(yǎng)液中的MMP-3及TIMP-1。結(jié)果：損傷后的軟骨細胞培養(yǎng)液中的MMP-3增多，TIMP-1分泌較少。地塞米松同銀杏葉提取物均可對抗IL-1β的效應，銀杏葉提取物的這種效應有劑量依賴性。結(jié)論：銀杏葉提取物通過調(diào)節(jié)受損傷后軟骨細胞MMP-3和TIMP-1生成，保護IL-1β?lián)p傷的膝關(guān)節(jié)軟骨細胞。

銀杏葉提取物；骨關(guān)節(jié)炎；基質(zhì)金屬蛋白酶；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑

銀杏葉提取物（ginkgo biloba extract，EGb）具有抗氧化、清除氧自由基、改善細胞代謝多方面作用,廣泛應用于抗衰老和心腦血管疾病的治療和保健。臨床應用可改善部分老年骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）患者的癥狀。本實驗選用EGb干預白介素-1β（interleukin-1，IL-1）損傷的兔膝關(guān)節(jié)軟骨細胞，通過觀察基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（tis-sue type inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)的變化探討其抗OA機制。

1 材料和方法

1.1 動物 雌性3個月齡新西蘭白兔1只（浙江大學實驗動物中心，許可證號：SYXK（浙）2007-0099號）。1.2 主要試劑及設(shè)備 DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；新生牛血清（北京鼎國生物技術(shù)公司）；無鈣鎂磷酸緩沖液（PBS）；青霉素-鏈霉素液（p/s）；胰蛋白酶（Sigma公司）；II型膠原酶（Invitrogen公司）；重組大鼠白介素-1β（IL-1β，Sigma公司）；銀杏葉提取物注射液（金納多注射液，德國威瑪舒培博士藥廠，Ginkgo biloba Extract761，EGb761）；地塞米松磷酸鈉注射液（上海通用藥業(yè)股份有限公司）；噻唑藍（MTT，Thiazolyl blue，Genview公司）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司）；考馬斯亮藍G-250(USA，F(xiàn)luka公司)，兔基質(zhì)金屬蛋白酶-3酶聯(lián)免疫試劑盒；兔基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1酶聯(lián)免疫試劑盒(美國ADL進口分裝)。

CO2恒溫孵育箱（美國NAPCO公司)、超凈工作臺(上海凈化設(shè)備廠)，IMT-2B型倒置顯微鏡（日本Olympus公司)、酶標比色儀（美國BIO-RAD公司)、721可見光分光光度計（上海光譜儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 軟骨細胞的分離和培養(yǎng)[1]雌性3個月齡新西蘭兔過量戊巴比妥鈉靜脈注射，處死后在半無菌條件下打開膝關(guān)節(jié)。用無菌解剖刀從關(guān)節(jié)面小心取出所用關(guān)節(jié)軟骨，分別由0.25%的胰蛋白酶溶液及0.02%II型膠原酶溶液消化獲得原代軟骨細胞。72 h后更換培養(yǎng)液。當細胞長滿單層的80%～100%后傳代培養(yǎng)。以組織化學甲苯胺藍染色法檢測，培養(yǎng)物的細胞外基質(zhì)部分若存在酸性糖胺多糖則呈異染性，呈藍色、紫紅色，據(jù)此鑒定軟骨細胞的表型(見圖1)。

圖1 原代軟骨細胞甲苯氨藍染色鑒定，光學顯微鏡下細胞呈異染性（×400）

1.3.2 銀杏葉提取物對白介素-1β?lián)p傷軟骨細胞MMP-3及TIMP-1的影響 取生長良好第2代的軟骨細胞，在培養(yǎng)液中配成1×105/mL濃度，接種96孔培養(yǎng)板中，每個培養(yǎng)孔100 μL，置于體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱。當細胞長滿單層的80%以上，棄去培養(yǎng)液及未貼壁的細胞。分別加入含IL-1β和藥物的含血清培養(yǎng)基，實驗時每孔加至180 μL。根據(jù)實驗分組如下：⑴正常軟骨細胞組，加入普通培養(yǎng)液。⑵IL-1β組，按濃度5 μg/L加入IL-1β。⑶IL-1β（5 μg/L）加地塞米松10-6mmol/L。⑷IL-1β（5 μg/L）加銀杏葉提取物（40 mg 、80 mg、160 mg/L）。每組6個平行樣本。培養(yǎng)24 h后吸出各組培養(yǎng)液按試劑盒說明方法測定MMP-3及TIMP-1含量。

2 結(jié)果

2.1 受試組軟骨細胞的形態(tài)學改變 倒置相差顯微鏡觀察下，IL-1β組軟骨細胞分布松散，生長較其他組的細胞慢，部分細胞變圓、皺縮，細胞活力下降。地塞米松組細胞形態(tài)及細胞活力較IL-1β組好，變圓、皺縮的細胞明顯減少，但不及正常組和銀杏葉提取物組。銀杏葉提取物組呈劑量依賴性的增加細胞的活力，其中高劑量組的細胞生長同正常組相似（見圖2）。

圖2 正常組、IL-1β組、地塞米松組（10-6mmol/L）、銀杏葉提取物高劑量組（160 mg/L）軟骨細胞形態(tài)（×400）

2.2 銀杏葉提取物對IL-1β?lián)p傷關(guān)節(jié)軟骨細胞MMP-3、TIMP-1的影響 IL-1β作用軟骨細胞后MMP-3分泌顯著增多，TIMP-1分泌顯著減少（P＜0.01）；EGb能對抗IL-1β的這種效應，并呈劑量依賴性；地塞米松也有同樣的效應（P＜0.05）（見表1）。

表1 EGb對IL-1β?lián)p傷關(guān)節(jié)軟骨細胞MMP-3和TIMP-1分泌的影響（±s，n=6）

表1 EGb對IL-1β?lián)p傷關(guān)節(jié)軟骨細胞MMP-3和TIMP-1分泌的影響（±s，n=6）

注：與正常組比較，﹡P＜0.01；與IL-1β組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與銀杏葉提取物80 mg/L組比較，☆P＜0.01

正常組IL-1β組地塞米松10-6mmol/L銀杏葉提取物40 mg/L銀杏葉提取物80 mg/L銀杏葉提取物160 mg/L MMP-3（ ng/mL）30.240 2±2.31 52.632 8±3.71﹡41.260 8±3.45△44.531 8±4.34△36.578 1±3.07△△30.501 8±3.09△△☆TIMP-1（ ng/mL）23.23±3.94 10.497±1.07﹡15.492 8±1.98△14.935±1.19△17.654 8±2.05△△19.659 1±2.04△△☆

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎的研究越來越多地證明，細胞因子在OA的發(fā)生、發(fā)展、惡化中起著重要的調(diào)節(jié)作用。同OA發(fā)病最密切相關(guān)的就是IL-1[1]。實驗表明，經(jīng)IL-1β處理后的軟骨細胞，在倒置顯微鏡下細胞活力降低、部分細胞變圓、皺縮。本實驗采用IL-1β作用于兔膝關(guān)節(jié)軟骨細胞，發(fā)現(xiàn)IL-1β作用軟骨細胞后MMP-3分泌顯著增多，TIMP-1分泌顯著減少，證實IL-1β的膝關(guān)節(jié)損害作用。

MMPs是降解骨有機質(zhì)(主要是膠原蛋白)的非常重要的酶之一。MMPs的活性可被特異性TIMPs所抑制。在關(guān)節(jié)軟骨的破壞中，MMP-3和TIMP-1尤為重要，這是因為MMP-3除了可降解Ⅳ型膠原，可能與OA早期膠原網(wǎng)絡(luò)水腫有關(guān)外，還可激活MMP-1，加速膠原的病理性降解，使與透明質(zhì)酸相連的可聚蛋白多糖由于網(wǎng)絡(luò)的松解而丟失；而TIMP-1則可抑制關(guān)節(jié)軟骨膠原纖維的釋放[2]。目前，臨床上將MMP-3和TIMP-1作為OA患者關(guān)節(jié)炎癥的血清標記物進行測定，并探討了OA患者MMP-3和TIMP-1的血清水平與疾病的活動相關(guān)性。

銀杏葉甘、苦、澀、平，入肺、脾、胃經(jīng)，具活血止痛、斂肺平喘、澀腸止瀉、止帶濁功效，是近年來應用比較廣泛的藥物。由于銀杏葉提取物具有的清除氧自由基、改善細胞的代謝活動等多方面的作用，銀杏葉提取物目前廣泛用于抗衰老和心腦血管疾病的治療和保健用藥[3]。在臨床應用中發(fā)現(xiàn)可改善部分老年OA患者的癥狀，本實驗研究結(jié)果顯示銀杏葉提取物對經(jīng)IL-1β?lián)p傷的軟骨細胞可以有效的減少MMP-3的生成，并增加TIMP-1的生成。進一步證實銀杏葉提取物對受損傷關(guān)節(jié)軟骨細胞具有保護作用。

[1]陳啟明，梁國德，秦嶺，等主譯.骨科基礎(chǔ)科學－骨關(guān)節(jié)肌肉系統(tǒng)生物學和生物力學〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：412.

[2]王毅，邢國勝，于順祿，等.IL-1β誘導軟骨細胞培養(yǎng)金屬蛋白酶/金屬蛋白酶抑制劑水平及藥物對其影響[J].中華風濕病學雜志，2003，(12)：718.

[3]Dubey AK，Shankar PR，Upadhyaya D，et al.Ginkgo biloba-an ap?praisal〔J〕.Kathmandu Univ Med J(KUMJ)，2004，2(3)：225.

Effect of Ginkgo Biloba Extract(EGb761)on MMP-3 and TIMP-1 and Damaged Chondrocytes of Knee-joint Injured by IL-1β in Rabbits

Zhao Dongjie,Wang Jun,He Bingrong.Zhejiang Provincial Hospi?tal of Traditional Chinese and Western Medicine（310003）,China

ObjectiveTo observe the protective effects of Ginkgo Biloba Extract(EGb761)on damaged chondrocytes of knee-joint injured by rratIL-1β in rabbits and to explore the protective mechanism of EGb761 through MMP-3 and TIMP-1.MethodsCartilaginous layers of knee were separated from three-month old Newzealand rabbit under semi-asepsis environment and then digested under sterile environment to get cartilagi?nous cells.The experimental cells were the second generation cartilaginous cells,identified with extracellular ma?trix in culture.These cells were observed by inverted microscopy and then were taken photos.Chondrocytes were divided randomly into six groups cultured with different cultures：rratIL-1β(5 μg/L)group,rratIL-1β(5 μg/L)with dexamethasone(10-6mmol/L)group,rratIL-1β(5 μg/L)with EGb761(40 mg,80 mg,160 mg/L)group and control group.After 24 hours,rabbit matrix MMP-13 and TIMP-1 content were detected by ELISA assay.ResultsThe production of MMP-13 was increased and TIMP-1 was decreased,Dexamethasone and EGb761 could rival the effect and EGb761 with dose-dependent response.ConclusionRGb761 could protect the damaged chondrocyte of articular genu injured by rratIL-1β in rabbit.The protective mechanism of EGb761 was to decrease production of MMP-13 and increase production of TIMP-1.EGb761 may be a new medicine to pre?vent osteoarthritis.

ginkgo biloba extract,osteoarthritis,matrix metalloproteinase,tissue type inhibitor of metallopro?teinases

R684.3；Q95-33

A

1007-6948(2011)01-0072-03

10.3969/j.issn.1007-6948.2011.01.026

浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院老年病科（杭州 310003）

趙東杰，Tel：0571-56109712,E-mail：zhaodongjie12 34@sina.com.cn

（收稿：2010-05-06 修回：2010-10-12）

（責任編輯 劉洪斌 田在善）