薛小平，鹿燕敏，李東華，劉洪斌

RP-HPLC法檢測大鼠血漿大黃酸含量的經(jīng)時變化

薛小平，鹿燕敏，李東華，劉洪斌

目的：觀察大鼠口服清熱解毒方后，其有效成分大黃酸在大鼠血漿中的經(jīng)時變化規(guī)律。方法：采用RP-HPLC法，色譜柱Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-0.1%磷酸（85∶15）為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫35℃。結(jié)果：大鼠口服清熱解毒方后，血漿中大黃酸1 h達峰值，之后緩慢下降，于12 h內(nèi)基本代謝完全。結(jié)論：采用反相高效液相色譜法檢測大鼠體內(nèi)藥物含量簡便、快捷，適合于研究中藥類成分的代謝特征。

大黃酸；反向高效液相色譜法；清熱解毒方

清熱解毒方主要由大黃、黃芩、白頭翁、敗醬草等組成，以東漢張仲景《金匱要略》瀉心湯方：“大黃二兩，黃連、黃芩各一兩”為基礎(chǔ)加減化裁而來。該方具有通里攻下、清熱瀉火、涼血解毒之功效。長期臨床觀察顯示，其對化膿性闌尾炎、闌尾膿腫及其他多種原因引起的腹腔感染等具有良好療效[1]。大黃酸是方中君藥大黃的主要成分之一，具有廣泛的藥理學活性[2]。本實驗采用反向高效液相色譜法，對口服清熱解毒方后不同時間點的大鼠血漿中的大黃酸的含量進行測定，探討清熱解毒方在大鼠體內(nèi)的代謝特征。

1 材料與方法

1.1 材料 Aglient1100高效液相色譜儀，安捷倫公司；電子天平（SARTORINS,德國）；高速低溫離心機（Laboratory Centrifuges 3K-30，美國Sigma）；KQ3200型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

大黃酸對照品購自中國藥品生物制品檢定所（批號0757-9804）；甲醇（天津市康科德科技有限公司）為色譜純，磷酸（天津市化學試劑三廠）、乙醚（天津市贏達稀貴化學試劑廠）均為分析純；硫酸為優(yōu)級純；水為自制重蒸水。清熱解毒方實驗用藥由華西藥學院提供，制成生藥量1 g/mL的濃縮煎劑（批號20081212）。

實驗動物：健康Wistar大鼠36只，體質(zhì)量(200±10)g，雌雄各半，由軍事醫(yī)學科學院四所動物室提供（合格證號：DD20013）。

1.2 方法[3-4]

1.2.1 色譜條件 色譜柱為Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-0.1%磷酸（85：15）為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長為254 nm，柱溫為35 ℃，進樣量為10 μL。

1.2.2 大黃酸對照品儲備液的制備 精密稱取大黃酸0.74 mg，加甲醇定容于10 mL棕色容量瓶中，置4℃冰箱保存。

1.2.3 給藥方法及血漿藥物提取 Wistar大鼠36只，隨機分為6組，每組6只，給藥前禁食12 h，自由飲水，按24 g生藥/kg體質(zhì)量灌胃給予瀉心湯中藥，分別于給藥后0.5、1、2、4、8、12 h各6只自腹主動脈取血，血樣經(jīng)肝素鈉抗凝后分取血漿4℃保存。

微量取樣器精密吸取大鼠血漿500 μL，置離心管中，加15%H2SO4250 μL，漩渦混合30 s，70℃水浴水解30 min，冷卻，加入乙醚4.0 mL，漩渦混合提取5 min，3 000 r/min離心5 min，吸取乙醚層，通入壓縮氮氣揮干。臨用前用甲醇溶解進樣。

1.2.4 定性定量方法 采用色譜峰保留時間進行定性分析，采用外標標準曲線法進行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性實驗 在本實驗條件下，大黃酸的峰形良好，與血漿中內(nèi)源性物質(zhì)分離良好，保留時間在6.23 min左右，見圖1～3。目標峰無雜峰干擾，本實驗具有較好的專屬性。

圖1 大鼠空白血漿中加入大黃酸對照品色譜圖(A為大黃酸)

圖2 大鼠口服清熱解毒方后血漿樣品中大黃酸的色譜圖(A為大黃酸)

圖3 大鼠空白血漿色譜圖

2.2 線性范圍及檢測限 精密吸取大黃酸對照品適量，加至6份正常大鼠血漿中，分別制成含大黃酸濃度為 0.37、0.74、1.48、2.22、2.96、3.7 μg/mL 的溶液，按1.2.3項下處理測定。以對照品質(zhì)量濃度X為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線并進行回歸計算，回歸方程：Y=35.516X－0.112 3，r2=0.999 1，n=6，大黃酸在0.37～3.7 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢測濃度為0.04 μg/mL。

2.3 回收率及精密度實驗 對照品揮干殘渣與空白血漿混合，配成分別含有大黃酸0.08、0.40、1.60 μg/mL的溶液，按1.2.3方法處理，每個濃度3份，分別取10 μL進樣，記錄峰面積A0。同時取大黃酸對照品用甲醇分別配制成相應濃度的溶液，每個濃度3份，取10 μL進樣，記錄峰面積A1，按萃取回收率（%）=A0/A1×100%計算（結(jié)果見表1）。上述濃度的含藥血漿在同一天重復測定5次，在1周內(nèi)不同日期重復測定5次，分別計算日內(nèi)和日間的相對標準偏差，日內(nèi)RSD分別為2.38%、2.25%、2.85%；日間RSD分別為3.05%、3.58%、3.73%。

表1 回收率實驗(±s，n=9)

表1 回收率實驗(±s，n=9)

編號1 2 3 4 5 6 7 8 9標準品濃度(μg/mL)0.08 0.08 0.08 0.40 0.40 0.40 1.60 1.60 1.60測得量(μg/mL)0.0572 0.0581 0.0575 0.289 0.292 0.291 1.189 1.125 1.157回收率(%)71.5 72.6 71.9 72.3 73.1 72.8 74.3 70.3 72.3加樣回收率(%)99.5 99.2 100.8 98.8 101 101.8 98.5 99 100.2

2.4 穩(wěn)定性實驗 將大鼠血漿樣品按2.3方法處理，分別于0、2、4、6、10、12 h，按上述色譜條件進行測定。樣品峰面積的RSD為3.25%，表明含藥血漿在常溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 大鼠血藥濃度測定 取大鼠不同時間點的血漿樣品，按照2.3方法處理，并依2.1色譜條件進行檢測，計算不同時間點血漿中大黃酸的濃度，結(jié)果見表2。繪制血漿中藥物濃度變化曲線，見圖4。

表2 不同時間大鼠血漿大黃酸含量測定(n=6)

圖4 大黃酸在大鼠血漿內(nèi)藥－時曲線(n=6)

3 討論

大黃是清熱解毒方的主要藥物之一，本實驗對大鼠口服清熱解毒方后血漿中大黃酸含量經(jīng)時變化進行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大黃酸吸收入血較快，代謝曲線呈單峰模式，說明這可能是清熱解毒方制劑比中藥湯劑起效快的原因所在。然而大黃酸只是其中的一個有效成分，中藥復方非常復雜，要全面闡明全部化學成分的吸收，分布，代謝和排泄規(guī)律難度很大，但通過本次實驗摸索，提示以高效液相色譜法來檢測各有效成分的體內(nèi)含量變化是便捷可行的，大黃酸的體內(nèi)代謝的探討為進一步開展復方藥物代謝特征的研究奠定了基礎(chǔ)。

[1]吳咸中.中西醫(yī)結(jié)合急腹癥方藥詮釋[M].天津：天津科學技術(shù)出版社,2001：340.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[Z].北京：化學工業(yè)出版社,2005：17.

[3]謝華,馬越鳴,王天明,等.桃核承氣湯及單味大黃中大黃酸在家兔體內(nèi)的藥代動力學[J].中藥藥理與臨床,2005,21(2)：1.

[4]朱偉,張莉,王學美,等.健康志愿者口服大黃制劑后大黃酸在人體內(nèi)的藥代學研究[J].中國中藥雜志,2005,30(18)：1458.

Ongoing Changes of Plasma Rhein Level in Mouse Tested by RP-HPLC

Xue Xiaoping,Lu Yanmin,Li Donghua,et alTianjin Institute of Acute abdominal Diseases by Integrated Traditional Chinese and Western Medi?cine,Tianjin(300100),china

ObjectiveTo observe the ongoing changes of plasma rhein level in mouse after orally taken QingReJieDu(清熱解毒)decoction.MethodsThe RP-HPLC analysis was carried out with a Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)column and a mobile phase of methanol-0.1%phosphoric acid solution(V：V=85：15).The flow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was 35℃,The detection wave length was set at 254 nm.ResultsOne hour after orally taken QingReJieDu decoction in mouse,the plasma rhein level reached a peak value,then decreased steadily and it was metabolized entirely in 12 hours.ConclusionThe ongoing changes of the content of rhein in mouse plasma can be shown by giving QingReJieDu decoction orally.This RP-HPLC is easy and fast to test the body content of some drugs,hence is suitably used in the study of metabo?lism features of some herbal medicine.

rhein,RP-HPLC,QingReJieDu prescription

R285.5；Q95-33

A

1007-6948(2011)01-0066-03

10.3969/j.issn.1007-6948.2011.01.024

天津市科技攻關(guān)計劃重大科技項目(05YFGDSFO2600)

天津市南開醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所（天津 300100）

劉洪斌,Tel：(022)27435368;E-mail：jtss@sina.com

（收稿：2010-03-20 修回：2010-06-22）

（責任編輯 田在善）