關(guān) 蕾，孫地武，劉長寶

VEGF-C和FLT-4在結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)

關(guān) 蕾1，孫地武2，劉長寶1

目的：研究VEGF-C和FLT-4在結(jié)直腸腺癌、癌旁組織以及正常腸組織的表達(dá)，探討其在結(jié)直腸腺癌淋巴轉(zhuǎn)移中的關(guān)系。方法：收集結(jié)直腸腺癌癌灶、癌旁組織和正常腸組織標(biāo)本，分別采用免疫組化、HE染色檢測癌灶組和癌旁組、正常組的VEGF-C表達(dá)水平，癌旁組與正常組的淋巴管數(shù)，并分析二者與結(jié)直腸腺癌淋巴轉(zhuǎn)移和臨床病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果：癌灶組和癌旁組、正常組的VEGF-C表達(dá)水平有顯著性差異，癌旁組與正常組的FLT-4(陽性淋巴管數(shù))表達(dá)水平具有顯著性差異，其中VEGF-C免疫組化染色的陽性率與FLT-4陽性染色脈管數(shù)在TNM分期中的0～I(xiàn)I期和III～I(xiàn)V期間有顯著性差異。結(jié)論：聯(lián)合檢測VEGF-C和FLT-4在結(jié)直腸腺癌灶及癌旁組織中的表達(dá)，對結(jié)直腸腺癌淋巴轉(zhuǎn)移有一定的預(yù)測價值，可以作為人結(jié)直腸腺癌淋巴轉(zhuǎn)移的預(yù)測指標(biāo)。

結(jié)直腸腺癌；VEGF-C；FLT-4；淋巴管生成；轉(zhuǎn)移

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)近年來在我國發(fā)病率及死亡率呈明顯上升趨勢。據(jù)報道,60%以上的患者于初次診斷時已發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)移,盡管采取了手術(shù)、放化療、免疫等綜合性治療措施,但其預(yù)后仍不容樂觀,術(shù)后5年生存率僅為40%～60%[1],約有80%～90%死于腫瘤轉(zhuǎn)移。結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率約為30%～50%，其中早期癌的轉(zhuǎn)移率約為10%[2-4]，淋巴轉(zhuǎn)移[5]嚴(yán)重影響結(jié)直腸癌患者的預(yù)后。我們于2009年4月—2010年6月，通過檢測淋巴管內(nèi)皮生長因子VEGF-C、血管內(nèi)皮生長因子受體家族成員FLT-4在結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)情況，分析其在臨床運用的可行性，為臨床上結(jié)直腸腫瘤的診治提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 全組共47例，結(jié)直腸癌組將標(biāo)本按取材部位分為原發(fā)灶癌組織、癌旁組織、遠(yuǎn)端腸管。其中，癌旁組織、遠(yuǎn)端腸管分別選取距離癌灶2 cm、10 cm處腸管。正常組織選取31例PPH術(shù)切除正常直腸組織標(biāo)本作為對照。結(jié)直腸癌組47例，年齡34～82歲，平均62.3歲。男34例，女13例。腫瘤最大直徑小于5 cm者20例，大于5 cm者37例。潰瘍型30例，非潰瘍型17例。管狀腺癌及乳頭狀腺癌45例，黏液腺癌2例。未達(dá)淺肌層8例，達(dá)深肌層14例，達(dá)漿膜層22例和漿膜外3例。高分化組12例，中分化組29例，低分化組6例。按TAM分期標(biāo)準(zhǔn)0期4例，I期5例，II期15例，III期14例，IV期9例。結(jié)腸組16例和直腸組31例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例。PPH組31例，年齡16～80歲，平均47.23歲。男19例，女13例。痔病23例（包括內(nèi)痔、外痔、混合痔），非痔病8例（包括直腸黏膜脫垂）。

1.2 組織標(biāo)本處理 遵照《病理學(xué)基礎(chǔ)與實驗技術(shù)》[6]，標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定24 h，分別取癌灶、癌旁（距離癌灶2 cm）、正常腸組織，裁成大小1 cm×1 cm×0.5 cm。常規(guī)脫水，透明、浸蠟、包埋，連續(xù)切片（4 μm/片），攤片、裱片、烤片。

1.3 HE染色 ⑴切片常規(guī)脫蠟。⑵蘇木素染色3 min。⑶1%鹽酸酒精中分化。⑷1%的氨水返藍(lán)10 s，自來水沖洗5 min。⑸伊紅染色1 min。⑹梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.4 免疫組織化學(xué)染色 每例石蠟組織均取切片5張，3張分別做VEGF-C和FLT-4蛋白免疫組化染色，1張進(jìn)行HE染色，1張作為陰性對照。切片常規(guī)脫蠟至水化,置2 000 mL枸櫞酸酸鹽緩沖液(pH 6.0)中,高壓加熱(95℃,7.5 min)修復(fù)抗原，3%H2O2室溫孵育10 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。一抗為兔抗人VEGF-C、FLT-4多克隆抗體（均購自北京中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)公司）。具體實驗步驟按照PV9000二步法免疫組化檢測試劑盒和DAB酶底物顯色試劑盒(購自北京中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)公司)說明書進(jìn)行。

1.5 檢測判斷 ⑴VEGF-C的計數(shù)方法和標(biāo)準(zhǔn)：在組織切片中VEGF-C顯示胞漿或胞膜染為淡黃色至棕褐色為陽性細(xì)胞標(biāo)志。在×40倍鏡下隨機選取5個具有代表性的VEGF-C陽性染色癌細(xì)胞最密集區(qū)，然后在×400倍視野下記數(shù)5個視野中的500個癌細(xì)胞(100個細(xì)胞/視野)，以陽性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞的百分率來表示(%)。⑵FLT-4陽性脈管判斷標(biāo)準(zhǔn)及記數(shù)方法：隨機選取切片，首先在×40倍鏡下尋找FLT-4陽性脈管密集區(qū)，確定每張切片5個淋巴管最多區(qū)域，再在×200視野下計數(shù)每個區(qū)域的淋巴管數(shù)，取平均值。凡不成腔、或有紅細(xì)胞、或伴有肌層的脈管均不予計數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 符合正態(tài)性分布的計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較采用兩樣本間t檢驗，計數(shù)資料組間采用χ2檢驗，兩個變量相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。所有數(shù)據(jù)處理均用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行運算。取顯著性檢驗水準(zhǔn)P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 HE結(jié)果 經(jīng)HE染色，顯示癌灶組均為腺癌，癌旁組均無未見癌細(xì)胞侵犯，正常組均為未見細(xì)胞異常，除有炎性表現(xiàn)外，基本為正常黏膜。見圖1～圖6。2.2 VEGF-C、FLT-4在結(jié)直腸癌、癌旁組織和正常

圖1 高分化腺癌×200（降結(jié)腸，女，53歲）

圖2 正常腸組織×400（直腸，男，35歲）

圖3 中分化腺癌×200（乙狀結(jié)腸，男，74歲）

圖4 癌旁組織×400（直腸，男，65歲）

圖5 低分化腺癌×200（直腸，男，65歲）

圖6 癌旁脈管組織×200（直腸，男，65歲）組織的免疫組化表達(dá) 癌旁組VEGF-C染色陽性率與癌灶組、正常組和癌旁組比較有顯著差異。癌旁組石蠟切片中FLT-4陽性染色脈管數(shù)與正常直腸組織中FLT-4陽性染色脈管數(shù)比較有顯著性差異。兩組免疫組化染色后計數(shù)結(jié)果見表1。

表1 結(jié)直腸癌、癌旁組織和正常組織中VEGF-C、FLT-4的表達(dá)(±s)

表1 結(jié)直腸癌、癌旁組織和正常組織中VEGF-C、FLT-4的表達(dá)(±s)

注：與癌灶組比較，*P<0.05,與正常組比較,△P<0.05

n FLT-4表達(dá)陽性淋巴染色脈管數(shù)組別癌灶組正常組癌旁組47 31 47 VEGF-C表達(dá)陽性率（n，%）45(95.7)16(51.6)*39(83.0)△4.30±1.49 9.06±3.1△

2.3 VEGF-C、FLT-4在不同臨床病理特點結(jié)直腸癌組中的表達(dá) ⑴按淋巴結(jié)是否有轉(zhuǎn)移將癌灶組分為兩個級別。⑵按照腫瘤最大直徑將癌灶組分為兩個級別，即直徑≤5 cm和＞5 cm。⑶按TNM分期將癌灶組分為0～I(xiàn)V期分級。

癌灶組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人中VEGF-C陽性表達(dá)率與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組VEGF-C陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。癌灶組的VEGF-C免疫組化染色的陽性率在按腫瘤大小分級的兩個級別間差異無顯著性。結(jié)直腸腺癌VEGF-C免疫組化染色的陽性率在0～I(xiàn)V期間有顯著性差異，表明VEGF-C的表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。癌旁組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人FLT-4陽性染色脈管數(shù)與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人FLT-4陽性染色脈管數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。癌旁組FLT-4陽性染色脈管數(shù)在按腫瘤大小分級的兩個級別間差異無顯著性，表明其與腫瘤大小無關(guān)。癌旁組FLT-4陽性染色脈管數(shù)在按腫瘤病理TNM分期的0～I(xiàn)I期和III～I(xiàn)V期間有顯著性差異，表明其與腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，見表2。

表2 癌灶組VEGF-C蛋白表達(dá)及FLT-4陽性染色脈管數(shù)與CRC臨床病理因素的關(guān)系(±s)

表2 癌灶組VEGF-C蛋白表達(dá)及FLT-4陽性染色脈管數(shù)與CRC臨床病理因素的關(guān)系(±s)

注：兩組間比較，*P<0.05

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有無VEGF-C陽性VEGF-C陰性陽性率（%）脈管數(shù)17 0 100 10.5±3.18 28 2 93.30 8.24±3.18*腫瘤最大直徑≤5 cm ＞5 cm 27 0 100 9.74±2.69 18 2 90 8.15±3.26 TNM分期0～I(xiàn)I III～I(xiàn)V 22 2 91.70 7.29±2.56 23 0 100*11.08±2.17*

3 討論

隨著我國疾病譜和飲食結(jié)構(gòu)的變化,結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈上升趨勢,特別是在城市上升更為明顯[7]。多年來，CRC的5年生存率始終徘徊在50%左右,原因主要在于結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移，其中淋巴轉(zhuǎn)移是常見的轉(zhuǎn)移途徑之一，也是影響預(yù)后最主要的因素。轉(zhuǎn)移是腫瘤的重要生物學(xué)特性，而淋巴轉(zhuǎn)移更是直接影響結(jié)直腸癌患者的預(yù)后[8]。因此，很多國內(nèi)外學(xué)者都致力于CRC淋巴轉(zhuǎn)移規(guī)律和機制方面的研究。隨著淋巴管標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，對腫瘤淋巴管生成和淋巴轉(zhuǎn)移的研究成為的研究熱點領(lǐng)域[9]。

本研究中癌旁組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人為17例，F(xiàn)LT-4陽性染色脈管數(shù)為（10.5±3.18）。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人為30例，F(xiàn)LT-4陽性染色脈管數(shù)為（8.24±3.18）。兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明癌旁組織的淋巴管增生，促進(jìn)了腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

Saaristo A等[10]研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-C誘導(dǎo)淋巴管生成，參與細(xì)胞水液代謝和免疫調(diào)節(jié)功能、炎癥增生、腫瘤轉(zhuǎn)移等過程。聯(lián)系Tammela等研究結(jié)果[11]，結(jié)合本實驗，可以認(rèn)為VEGF-C是腫瘤細(xì)胞分泌的，并可能通過旁分泌與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上的FLT-4結(jié)合，激活后者來調(diào)控淋巴管的功能變化，促進(jìn)腺癌的發(fā)生發(fā)展、播散轉(zhuǎn)移。VEGF-C和FLT-4的增加導(dǎo)致轉(zhuǎn)移增高的原因可能是VEGF-C與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上的FLT-4結(jié)合并激活后者，調(diào)節(jié)淋巴管的生長能力和通透性，誘導(dǎo)癌周的淋巴管增生和擴(kuò)張，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對淋巴管的侵襲，增加腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機會。

目前，臨床上判斷結(jié)直腸癌是早期還是中晚期，主要依靠術(shù)前CT[12]或腹部B超檢查是否有淋巴轉(zhuǎn)移，低位直腸癌可行直腸內(nèi)B超檢測浸潤范圍[13]，術(shù)中術(shù)者在術(shù)野下可判斷有否是淋巴轉(zhuǎn)移。但是，對于離腫瘤較遠(yuǎn)的淋巴結(jié)或僅有微小轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)，其診斷準(zhǔn)確率明顯降低。若術(shù)前或術(shù)中未發(fā)現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移，手術(shù)未行淋巴結(jié)清掃，或清掃不徹底，而僅依靠術(shù)后病理判斷患者結(jié)直腸癌分期，則會影響患者預(yù)后，乃至生存率。所以，亟待一種術(shù)前的檢測作為參考指標(biāo)，判斷手術(shù)方案。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，癌旁組FLT-4陽性染色脈管數(shù)在按腫瘤病理TNM分期的0～I(xiàn)I期和III～I(xiàn)V期間有顯著性差異，表明其與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。同時，結(jié)直腸腺癌原發(fā)灶VEGF-C的陽性率在0～I(xiàn)V期間也有顯著性差異，表明VEGF-C的表達(dá)也與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。筆者認(rèn)為，臨床醫(yī)生可根據(jù)術(shù)前血清中的FLT-4及VEGF-C水平，預(yù)測腫瘤患者是否有淋巴結(jié)和遠(yuǎn)隔器官轉(zhuǎn)移，判斷是否有微小轉(zhuǎn)移灶的存在，為手術(shù)方案、術(shù)后是否行化療以及化療方案提供了依據(jù)。

在臨床應(yīng)用中,我們認(rèn)為VEGF-C和FLT-4可以作為檢測指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用，有利于結(jié)直腸腫瘤轉(zhuǎn)移的綜合判斷，改善疾病的預(yù)后。尤其是在對DukesB期病人治療上，對其手術(shù)中是否進(jìn)行淋巴結(jié)清掃，及術(shù)后是否進(jìn)行化療，有重要參考價值。

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Expression of VEGF-C and FLT-4 in Colorectal Carcinoma and Correlation with Tumor Metastasis

Guan LeiSun Diwu Liu Changbao.The SecondAffiliatedHospital of Wenzhou Medical College，Zhejiang Province(325027)，China

ObjectiveTo investigate the expression in colorectal adenocarcinoma of the relationship be?tween the lymph node metastases，and to provide support for whether lymphatic cleaning and to postoperative chemotherapy should be done to patients.MethodsThe colorectal adenocarcinoma foci adjacent tissues and normal colorectal mucosa specimens were Collected and detected them respectively with PV9000 2-step immuno?histochemical staining and HE staining：VEGF-C expression levels：the expression of VEGF-C in the primary fo?ci of colorectal carcinoma,adjacent tissues and the normal group;the numbers of lymphatic in paraneoplastic group and normal group;and the relation between these two things and the lymphatic metastasis of colorectal ad?enocarcinoma and clinical pathological features was analyzed.ResultsThe expressions of VEGF-C in colorec?tal adenocarcinoma foci,paraneoplastic group and the normal group are significantly different.The expressions of FLT-4 in paraneoplastic group and normal groups are strikingly different.The positive rate of the VEGF-C immunohistochemistry pigmentation and the number of FLT-4 masculine pigmentated vessels are quite different in the 0-II and III-IV periods in the TNM division.ConclusionTo jointly detect the expression of VEGF-C and FLT-4 in the colorectal adenocarcino?ma foci and paraneoplastic group of colorectal adeno?carcinoma is quite valuable in the prediction of the lymphatic metastasis in human being’s colorectal adenocarci?noma.The joint detection can be used as prediction index to the lymphatic metastasis in human being’s colorec?tal adenocarcinoma and it is with great reference value especially to the treatment of the patients in clinical Dukes B period.

Colorectal Neoplasms,Vascular Endothelial Growth Factor C，VEGF Receptor-3,Lymphatic Metastasis(metastasis)

R735.3+5

A

1007-6948(2011)01-0056-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2011.01.021

溫州市科技局項目（Y20090436）

1.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院肛腸科(溫州 325027)

2.成都軍區(qū)空軍機關(guān)醫(yī)院外科

劉長寶,Tel：0577-88086251，E-mail：lcb@wzhealth.com

（收稿：2010-08-20 修回：2010-11-22）

（責(zé)任編輯 孔 棣）