宋毓平 田 訓(xùn)敖啟林

(湖北省武漢市東湖醫(yī)院皮膚科,武漢430074;1湖北省武漢市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科,武漢430014;2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院病理研究所,同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系,武漢430030)

Anti-HIF-1α-pEGFP重組質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)

宋毓平 田 訓(xùn)1＊敖啟林2

(湖北省武漢市東湖醫(yī)院皮膚科,武漢430074;1湖北省武漢市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科,武漢430014;2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院病理研究所,同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系,武漢430030)

目的 構(gòu)建EGFP-HIF-1α反義重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染人宮頸癌 Hela細(xì)胞,用以探討 HIF-1α蛋白在宮頸癌的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移中的作用。方法 應(yīng)用基因重組技術(shù)構(gòu)建EGFP-HIF-1α反義重組質(zhì)粒,通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)將其轉(zhuǎn)染入 Hela細(xì)胞,倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果,Western blot檢測(cè)HIF-1α蛋白的表達(dá)。結(jié)果 酶切鑒定結(jié)果顯示含 EGFP-HIF-1α反義重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,并能在Hela細(xì)胞中封閉HIF-1α蛋白的表達(dá)。結(jié)論 EGFP-HIF-1α反義重組質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染成功,封閉Hela細(xì)胞中HIF-1α蛋白的表達(dá),為進(jìn)一步研究HIF-1α蛋白在宮頸癌的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移中的作用提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

HIF-1α基因;重組質(zhì)粒;基因轉(zhuǎn)染;基因表達(dá)

目前的研究表明,在已知的腫瘤中大約有90%為實(shí)體瘤[1],缺氧作為惡性實(shí)體瘤的特征之一,改變了腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的遺傳不穩(wěn)定性及惡性選擇。缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factors-1,HIF-1)是在缺氧條件下廣泛存在于人體的一種轉(zhuǎn)錄因子,研究證實(shí) HIF-1在動(dòng)物及人體許多腫瘤中大量表達(dá),對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)、血管形成、轉(zhuǎn)移、凋亡及耐藥皆有影響,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,人們逐漸認(rèn)識(shí)到 HIF-1α基因在其中的中樞地位,進(jìn)一步研究 HIF-1α的調(diào)控及其結(jié)構(gòu),以及細(xì)胞缺氧時(shí)如何調(diào)整其基因的表達(dá),將具有重要的意義,隨著 HIF-1α研究的深入,以HIF-1α為靶點(diǎn)的治療可能成為腫瘤治療和預(yù)防的重要手段之一[2]。

本文選擇 HIF-1α作為研究對(duì)象,利用基因重組技術(shù)構(gòu)建EGFP-HIF-1α反義重組質(zhì)粒,運(yùn)用脂質(zhì)體將EGFP-HIF-1α反義重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Hela細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)封閉研究,為進(jìn)一步研究 HIF-1α蛋白在惡性腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的作用提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料和方法

1.反義 HIF-1α基因片段的獲取

收集Hela細(xì)胞,用 TRIZOLTM試劑一步法提取細(xì)胞總RNA。PCR引物序列如下:反義HIF-1α(800bp):Upper 5′-CGGGATCCGGTGA TTTGGATATTGAAGATGAC-3′;Lower 5′-CGGGATCCGGTGATTTGGATA TTGAAGATGAC-3′。PCR反應(yīng)條件為:94℃40s,58℃(60℃) 40s,72℃1min,共30個(gè)循環(huán)。取10μl陳PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離,紫外燈下觀察并拍照。每個(gè)樣本至少重復(fù)三遍。

2.EGFP-HIF-1α反義重組質(zhì)粒的構(gòu)建

真核表達(dá)載體pEGFP-C1購(gòu)自Clontech公司。分別利用載體和目的基因兩端的BglII和EcoRI酶切位點(diǎn),用BglII和 EcoRI分別將反義 HIF-1α和載體pEGFP-C1雙酶切,獲取反義 HIF-1α基因片段和線性載體,瓊脂糖凝膠電泳顯示酶切結(jié)果正確后,用玻璃奶回收試劑盒回收目的片段和線性載體。酶切的反義HIF-1α基因與pEGFP-C1載體用T4 DNA連接酶(Invitrogen)連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α,涂布在含100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板。挑取抗氨芐青霉素的克隆,質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒,獲取的質(zhì)粒用BglII和 EcoRI雙酶切,根據(jù)凝膠上電泳分析,鑒別出插入有反義HIF-1α基因的重組質(zhì)粒EGFP-HIF-1α反義重組質(zhì)粒。

3.細(xì)胞培養(yǎng)

Hela細(xì)胞于含3 mmol/L、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,在37℃,5%CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)。

4.基因轉(zhuǎn)染

將EGFP-HIF-1α反義重組質(zhì)粒在宿主菌中大量擴(kuò)增,用 Eppendorf Perfectprep Plasmid Maxi試劑盒大量提取質(zhì)粒,無(wú)菌條件下提純,以備基因轉(zhuǎn)染用。根據(jù)脂質(zhì)體LipoFectamine2000(Invitrogen)試劑說(shuō)明書(shū),取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、狀態(tài)良好的細(xì)胞,調(diào)細(xì)胞密度為2×105個(gè)/ml,接種于6孔板內(nèi),培養(yǎng)24h,待細(xì)胞融合至50%-60%,將脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物加入,無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4小時(shí)后,終止轉(zhuǎn)染,繼續(xù)培養(yǎng)12h,倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果。48h后換含不同濃度 G418的篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)。

5.細(xì)胞化學(xué)性低氧模型的建立

取對(duì)數(shù)期增長(zhǎng)的 Hela、EGFP-C1 Hela、EGFP-HIF-1α反義Hela三組細(xì)胞,向培養(yǎng)基中加入經(jīng)直徑為0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后的CoCl2,按終濃度為50、100、150、200、250μm/L分組,持續(xù)培養(yǎng)3-5代,使細(xì)胞在該濃度CoCl2作用下穩(wěn)定生長(zhǎng)傳代。

6.蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting)

收集低氧模型生長(zhǎng)的 Hela、EGFP-C1 Hela、EGFP-HIF-1α反義 Hela三組細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白。取50μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳,并采用半干電轉(zhuǎn)移儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)上;用含0.05%Tween20的 TBS緩沖液(TBST)配制5%脫脂奶,水平搖床室溫振搖封閉NC膜2h;用TBST液稀釋的兔抗人 HIF-1α單抗(1:500)于4℃孵育NC膜過(guò)夜;TBST液漂洗3次,各10 min,加入相應(yīng)的堿磷酶標(biāo)記的二抗(1:500),水平搖床室溫振搖1h,TBST液再次漂洗 3次,各 10 min;用顯色底物 NBT/ BCIP/buffer(1:1:50)顯色。

結(jié) 果

1.EGFP-HIF-1α反義重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定構(gòu)建的 EGFP-HIF-1α反義重組質(zhì)粒用BglII和EcoRI雙酶切后,電泳可見(jiàn)約的800bp目的片段和4362bp載體片段,酶切結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符。見(jiàn)圖1。

圖1 反義EGFP-HIF-1α重組質(zhì)粒的限制性?xún)?nèi)切酶酶切圖譜分析Fig.1 The analysis of the recombinant plasmid anti-EGFP-HIF-1αdigested by restriction enzyme

2.轉(zhuǎn)染結(jié)果 EGFP-HIF-1α反義重組質(zhì)粒和EGFP-C1轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞24h后加入 G418(終濃度為100-1000μg/ml),用未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的 Hela細(xì)胞作陰性對(duì)照。含 G418 1000μg/ml終濃度的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后,實(shí)驗(yàn)組部分細(xì)胞失去貼壁生長(zhǎng)能力。更換 G418濃度降到500μg/ml,繼續(xù)培養(yǎng),轉(zhuǎn)基因細(xì)胞多數(shù)仍貼壁生長(zhǎng),但增殖緩慢,而對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染)的細(xì)胞經(jīng) G418篩選已全部死亡浮起,陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆貼壁生長(zhǎng)(圖2A, 2B),表明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功,穩(wěn)定 G418濃度進(jìn)行篩選出生長(zhǎng)良好的轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒細(xì)胞和空白載體細(xì)胞,繼續(xù)傳代培養(yǎng)并冷凍保存。

圖2 含G418的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的 Hela細(xì)胞.A.轉(zhuǎn)染反義 EGFP-HIF-1α重組質(zhì)粒的 Hela細(xì)胞;B.轉(zhuǎn)染EGFP-C1的Hela細(xì)胞Fig.2 Transfected Hela cells screened by G418 in DMEM.A.Hela cells transfected with the recombinant plasmid anti-EGFP-HIF-1α;B.Hela cells transfected with EGFP-C1

3.Western blotting結(jié)果分析收集細(xì)胞,裂解后取上清液,蛋白質(zhì)變性,常規(guī)SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,按Western blot試劑盒說(shuō)明操作,蛋白免疫印跡結(jié)果顯示未轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒和僅轉(zhuǎn)染EGFP-C1質(zhì)粒的 Hela細(xì)胞中有 HIF-1α蛋白的表達(dá)條帶,而經(jīng)轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞無(wú)表達(dá)(圖3)。

圖3 Hela、EGFP-C1 Hela、EGFP-HIF-1α反義Hela三組細(xì)胞缺氧環(huán)境下的 HIF-1α蛋白表達(dá);1.反義 EGFP-HIF-1α轉(zhuǎn)染后的 Hela細(xì)胞(Anti);2.EGFP-C1轉(zhuǎn)染后的 Hela細(xì)胞(control);3.Hela細(xì)胞(HeLa).Fig.3 The expressions of HIF-1αprotein in Hela cells untreated or those transfected with anti-EGFP-HIF-1αor EGFP-C1;1.Hela cells transfected with anti-EGFP-HIF-1α(Anti);2.Hela cells transfected with EGFP-C1(Control);3.Hela cells untransfected(HeLa)

討 論

在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中,由于腫瘤生長(zhǎng)迅速,其增生速度超過(guò)周?chē)艿纳L(zhǎng)速度,導(dǎo)致局部缺氧,進(jìn)而誘導(dǎo) HIF-1的表達(dá),可見(jiàn) HIF-1不僅是調(diào)節(jié)氧動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)鍵因子,而且與腫瘤的演進(jìn)關(guān)系密切。腫瘤細(xì)胞存在著對(duì)缺血缺氧的自身調(diào)節(jié)和適應(yīng),其機(jī)制主要通過(guò)提高葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、糖酵解(Warburg效應(yīng))及腫瘤血管形成。Heather等[3]從免疫組織化學(xué)資料中發(fā)現(xiàn) HIF-1α在腫瘤生物學(xué)中發(fā)揮重要作用,在良性腫瘤組織中,HIF-1α處于正常水平,在許多原發(fā)性惡性腫瘤中 HIF-1α水平升高,而在轉(zhuǎn)移性腫瘤,HIF-1α水平升高更加顯著。隨著實(shí)體瘤的增大,腫瘤內(nèi)部不能得到足夠血液供應(yīng),導(dǎo)致局部處于缺血缺氧狀態(tài)。因此, HIF-1α的過(guò)表達(dá)可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

近期有學(xué)者通過(guò)免疫組化法對(duì)宮頸癌患者進(jìn)行HIF-1α的檢測(cè),其陽(yáng)性率高達(dá)72.1%,并發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞大部分集中在腫瘤壞死邊緣,而且與腫瘤的臨床分期、大小、組織學(xué)類(lèi)型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及病理分級(jí)無(wú)關(guān),Fujimoto[4]等認(rèn)為,在宮頸癌中, HIF-1α的表達(dá)與組織學(xué)類(lèi)型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān),但其水平在進(jìn)展期宮頸癌患者中顯著升高,徐軍[5]等研究表明 HIF-1α在宮頸癌中的表達(dá)與宮頸鱗癌的腫塊大小、國(guó)際婦產(chǎn)科協(xié)會(huì)分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤壞死密切相關(guān)。HIF-1α作為細(xì)胞氧平衡和缺氧誘導(dǎo)基因表達(dá)的中心調(diào)節(jié)子 ,能接受多種條件的刺激 ,同時(shí)又能調(diào)節(jié)多種酶或者生長(zhǎng)因子,促使腫瘤細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下獲得更多的能量和血液供應(yīng)進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。因此,進(jìn)一步研究HIF-1α在宮頸癌中的功能和調(diào)控機(jī)制 ,將可能成為宮頸癌診斷和治療的新思路。

目前,HIF-1α在臨床方面的研究還處于初級(jí)階段 ,其與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系還不十分明了。其次HIF-1α在腫瘤治療方面的研究仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段,以缺氧為基礎(chǔ)的選擇性治療方案尚未應(yīng)用于臨床,但顯示潛在前景的治療策略正在實(shí)驗(yàn)室和臨床試驗(yàn)的研究之中,它極有可能為腫瘤的治療提供一條新的出路。本研究采用人宮頸腫瘤Hela細(xì)胞作為細(xì)胞模型,利用帶有熒光標(biāo)記的真核表達(dá)載體pEGFP-C1,構(gòu)建含有反義 HIF-1α的真核表達(dá)重組體反義EGFP-HIF-1α。進(jìn)而將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到 Hela腫瘤細(xì)胞,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Hela細(xì)胞后用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,選擇抗性克隆,將新的克隆細(xì)胞挑選出擴(kuò)大培養(yǎng)。用免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株表達(dá) HIF-1α蛋白的情況,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞株表達(dá)的 HIF-1α蛋白水平下降。通過(guò)本次試驗(yàn)可為進(jìn)一步探索 HIF-1α在宮頸癌中的作用提供一理想對(duì)照試驗(yàn)細(xì)胞模型及試驗(yàn)依據(jù)。

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[2]張俊文,王丕龍.缺氧誘導(dǎo)因子在惡性腫瘤中的作用.腫瘤防治研究,2004,31(2):911

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[5]徐軍,施紅旗,劉慶偉,等.HIF1α、VEGF在宮頸鱗癌中的表達(dá)及臨床意義.浙江實(shí)用醫(yī)學(xué),2006,11(1):628

CONSTRUCTION AN D EXPRESSIONOF RECOMBINANT PLASMID ANTI-EGFP--HIF-1αIN HE LA CE LLS

Song Yuping,Tian Xun1＊,Ao Qilin2
(Department of Dermatology,Donghu Hospital of Wuhan,Wuhan430074;1Department of Obstetrics&Gynecology,The Central Hospital of Wuhan,Wuhan430014;2Institute ofPathology,Tongji Hospital,and Department ofPathology, Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan430030,China)

Objective To construct and transfect HIF-1α(hypoxia-inducible factors)gene recombinant antisense plasmid pEGFP-HIF-1αin order to detect the function of the HIF-1αprotein.Methods Recombinant antisense pEGFP-HIF-1αwas cloned into an eukaryotic expression vector,and transfected into Hela cells by lipofectamine mediated gene transfer.The efficiency of tranfection was determined by microscopy,and the block of HIF-1αwas detected by Western blot.Results The recombinant antisense plasmid pEGFP-HIF-1αwas correctly cloned.The block of HIF-1αgene expression was detected distinctly after transfection.Conclusion The antisense pEGFP-HIF-1αwas effectively cloned and transfected,which can be used to further study the fuction of HIF-1αprotein.

Hypoxia-inducible factors;Recombinant plasmid;Gene transfection;Gene expression

R361

A

10.3870/zgzzhx.2010.04.019

2010-02-05

2010-05-20

宋毓平,女(1980年),漢族,學(xué)士。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)