劉 莉馬 爽顧海倫任亞浩楊 軍

(1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室沈陽110001;2中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院骨外科沈陽110004)

大鼠脂肪基質(zhì)細(xì)胞成脂分化及慢病毒感染的實(shí)驗(yàn)研究

劉 莉＊1馬 爽1顧海倫2任亞浩1楊 軍1

(1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室沈陽110001;2中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院骨外科沈陽110004)

目的 誘導(dǎo)大鼠脂肪基質(zhì)細(xì)胞成脂分化,觀察慢病毒感染效果。方法 大鼠脂肪基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)至第3代后,間接免疫熒光法鑒定細(xì)胞表面抗原CD44,并采用MTT法繪制生長(zhǎng)曲線;第3代基質(zhì)細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞,油紅O染色法鑒定,并行慢病毒感染。結(jié)果 第3代脂肪基質(zhì)細(xì)胞表面抗原CD44表達(dá)呈陽性;細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈“S”形。細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)分化劑誘導(dǎo)10d后,胞內(nèi)有大量脂滴形成,脂滴大小不等。油紅O染色顯示脂滴被染成紅色;攜帶GFP報(bào)告基因的慢病毒可感染成熟脂肪細(xì)胞,感染率約為80%,且細(xì)胞被感染后狀態(tài)良好。結(jié)論 慢病毒可高效感染由大鼠脂肪基質(zhì)細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化成的脂肪細(xì)胞,為研究脂肪細(xì)胞的基因功能、相關(guān)疾病的基因治療提供了一個(gè)有效工具。

脂肪基質(zhì)細(xì)胞;成脂分化;慢病毒;感染

肥胖的發(fā)病率正逐年上升,與2型糖尿病、高血壓、高血脂等疾病密切相關(guān)。肥胖可表現(xiàn)為脂肪細(xì)胞體積增大和/或脂肪細(xì)胞數(shù)目增多。因此,關(guān)于脂肪細(xì)胞分化、發(fā)育及代謝調(diào)節(jié)的研究對(duì)于揭示肥胖的發(fā)病機(jī)制具有重要作用。目前,利用基因工程技術(shù)將外源基因?qū)爰?xì)胞或敲減細(xì)胞中的某個(gè)特定基因來研究基因功能越來越被廣泛應(yīng)用,但成熟脂肪細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中,生命周期短,很難進(jìn)行轉(zhuǎn)染。而脂肪組織來源的基質(zhì)細(xì)胞(adipose-derived stromal cells,ADSCs)增殖能力強(qiáng),可在特定條件下誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞,是研究脂肪細(xì)胞基因功能的有效工具。因此,本研究從大鼠附睪脂肪組織中分離培養(yǎng)出ADSCs,鑒定其表型并誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞后,采用慢病毒感染,觀察其感染效率及生長(zhǎng)狀況,為在脂肪細(xì)胞中研究基因功能提供有效工具。

材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar雄性大鼠,體重120-140g,購(gòu)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。

2.主要試劑與儀器

2.1 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco美國(guó)),慢病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)p Helper 1.0,p Helper 2.0和p GCSILGFP(上海吉?jiǎng)P生物技術(shù)有限公司),兔抗CD44抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司),FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

2.2 儀器

超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司), CO2培養(yǎng)箱(Kendro德國(guó)),倒置相差顯微鏡(O1ympus日本),酶標(biāo)儀(Tecan瑞士)

3.實(shí)驗(yàn)方法

3.1 大鼠脂肪基質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)

無菌條件下取大鼠附睪周圍脂肪組織,II型膠原酶37℃水浴消化約1h。過250μm篩網(wǎng)后離心,沉淀加DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基混懸,計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞數(shù) 2-3×105個(gè)/ml,接種于 25cm2培養(yǎng)瓶(5ml/瓶)。37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24h后首次換液。細(xì)胞約80%融合時(shí),胰酶消化傳代。

3.2 間接免疫熒光法鑒定細(xì)胞表面抗原

第3代細(xì)胞爬片,4%多聚甲醛固定10min, 0.01mol/LPBST(含0.1%TritonX-100 p H 7.4)漂洗5min 3次;加入2%BSA,37℃濕盒內(nèi)封閉30min,加兔抗CD44抗體(1:50稀釋)4℃孵育過夜;加 FITC標(biāo)記的二抗,37℃濕盒避光作用30min,熒光鏡檢,拍照。

3.3 MTT法繪制生長(zhǎng)曲線

取第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,消化后制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度為5 103/ml,接種于96孔板,每孔100μl(6個(gè)復(fù)孔),對(duì)照孔(2個(gè)復(fù)孔)僅加入培養(yǎng)基,置37℃、5%CO2溫箱培養(yǎng),每3d換液一次。接種后第1天到第10天,每天取96孔板進(jìn)行檢測(cè)。具體方法為每孔加入 10μl 0.5% MTT,4h后吸出孔內(nèi)液體,加入100μl三聯(lián)液, 12h后酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光密度值。取均值后以時(shí)間為橫坐標(biāo),光密度為縱坐標(biāo),繪制生長(zhǎng)曲線。

3.4 大鼠脂肪基質(zhì)細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化

當(dāng)?shù)?代大鼠脂肪基質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)成單層后,用PBS洗2次,更換誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)添加胰島素70nmol/L、地塞米松100nmol/L、右旋泛酸17μmol/L、生物素33μmol/L、異丁基-甲基黃嘌呤5mmol/L和羅格列酮0.5μmol/L)培養(yǎng)3d后,隔日更換誘導(dǎo)分化后培養(yǎng)基(去除異丁基-甲基黃嘌呤及羅格列酮)。誘導(dǎo)分化后第10d進(jìn)行油紅O染色鑒定及慢病毒感染。

3.5 油紅O脂肪染色法鑒定脂肪細(xì)胞

固定:即取誘導(dǎo)分化10d后細(xì)胞,棄除培養(yǎng)基,10%甲醛漂洗5min,更換等體積10%甲醛,至少固定1h。分色:棄掉甲醛,60%異丙醇清洗細(xì)胞,讓細(xì)胞完全干燥。染色:油紅O工作液染色10min,棄掉液體,立即用去離子水清洗4次。光學(xué)顯微鏡下觀察,被染成紅色的細(xì)胞即為脂肪細(xì)胞,拍照記錄。

3.6 慢病毒感染脂肪細(xì)胞

構(gòu)建攜帶報(bào)告基因的慢病毒載體及進(jìn)行病毒包裝,見本實(shí)驗(yàn)室Liu等已發(fā)表文獻(xiàn)[1]。感染前為細(xì)胞換新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基,以復(fù)感染指數(shù)(multiplicity of infection,MOI)值50,每孔加入感染培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基 +5μg/ml polybrene)和病毒共500μl。37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24h,更換新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基。96h后熒光鏡檢觀察感染效果。

結(jié) 果

1.大鼠脂肪基質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)及免疫熒光結(jié)果

原代細(xì)胞培養(yǎng)24h后,貼壁的細(xì)胞呈短梭形、三角形或小多角形,大小不等,7d左右達(dá)80%融合。傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)較快,為成纖維細(xì)胞形。間接免疫熒光法顯示第3代ADSCs的CD44表達(dá)呈陽性(圖1)。

2.大鼠脂肪基質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

生長(zhǎng)曲線呈“S”形,前3d為潛伏期,第4天開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期持續(xù)至第6d,第7天達(dá)到高峰,然后進(jìn)入平臺(tái)期。

圖2 第3代大鼠脂肪基質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(MTT法)Fig.2 The growth curve of rat adipose-derived stromal cells in generation 3(MTT assay)

3.大鼠脂肪基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化

第3代細(xì)胞長(zhǎng)成單層后,經(jīng)成脂誘導(dǎo)分化劑誘導(dǎo)10d,可見細(xì)胞變圓,體積增大,胞內(nèi)有大量脂滴形成,隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng),小脂滴逐漸融合成大脂滴(圖3),油紅O染色顯示脂滴被染成紅色,未分化基質(zhì)細(xì)胞不著色(圖4)。

4.慢病毒感染成熟脂肪細(xì)胞

攜帶GFP報(bào)告基因的慢病毒可高效感染成熟脂肪細(xì)胞,感染率約為80%。細(xì)胞被感染后狀態(tài)良好(圖5A,5B)。

討 論

脂肪組織來源的基質(zhì)細(xì)胞(ADSCs)是一類存在于脂肪組織中,具有多種分化潛能的細(xì)胞。在不同誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的作用下,ADSCs可分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等[2-4]。但其特異性標(biāo)記目前還不十分清楚,一般認(rèn)為,ADSCs表面抗原CD29、CD44、CDl05、CDl06、CDl66等為陽性。本試驗(yàn)采用間接免疫熒光法檢測(cè)分離培養(yǎng)的第 3代 ADSCs表面抗原CD44表達(dá)呈陽性,與以往的研究結(jié)果一致[5]。MTT結(jié)果顯示,第3代大鼠脂肪基質(zhì)細(xì)胞接種后,經(jīng)過3天的潛伏期,進(jìn)入到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,4天后進(jìn)入到平臺(tái)期。Qu[6]等報(bào)道,傳代培養(yǎng)的豬ADSC潛伏期約為24-48h,對(duì)數(shù)增殖期為6天,接種后第9天進(jìn)入平臺(tái)期。結(jié)果的差異可能與細(xì)胞種屬、接種密度和傳代數(shù)有關(guān)[7]。

大量研究顯示,人體內(nèi)的脂肪組織不但可以合成并儲(chǔ)存甘油三酯,而且還具有內(nèi)分泌功能,由其分泌的因子,如瘦素、腫瘤壞死因子α等參與機(jī)體的代謝、免疫等生理過程。因此,作為脂肪組織主要組成成分的脂肪細(xì)胞的研究已成為眾多學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。由于成熟脂肪細(xì)胞為終末分化細(xì)胞,內(nèi)含大量脂滴,非常脆弱、易碎,在培養(yǎng)時(shí)漂浮在液面上,培養(yǎng)幾天后,大部分細(xì)胞會(huì)破裂死亡,無法長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)、傳代,這對(duì)于進(jìn)行基因過表達(dá)或敲減的實(shí)驗(yàn)造成很大困難,而采用脂肪基質(zhì)細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞后,再進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn),則使這一難題獲得解決。常見的基因轉(zhuǎn)染的方法是將需要轉(zhuǎn)入的外源基因克隆到質(zhì)粒載體上,通過轉(zhuǎn)染試劑導(dǎo)入,對(duì)于成熟的脂肪細(xì)胞而言,質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率很低(<10%)。而慢病毒(Lentivirus)載體是一種HIV-1(人類免疫缺陷I型病毒)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體,與其他病毒載體系統(tǒng)相比,慢病毒具有感染分裂和非分裂的細(xì)胞并穩(wěn)定表達(dá)基因,無明顯免疫原性等特點(diǎn),特別適合于在難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中進(jìn)行基因功能研究,并且在感染后可以整合到受感染細(xì)胞的基因組,進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定表達(dá)[8]。慢病毒感染效果與感染MOI值有密切關(guān)系,一般來說,在一定MOI值范圍內(nèi),MOI值越大,感染效率越高,但超過一定MOI值時(shí)感染效率反而會(huì)出現(xiàn)下降,這是由于在過高的MOI值下,病毒的細(xì)胞毒性致使細(xì)胞死亡,引起感染效率的降低。本研究用攜帶 GFP報(bào)告基因的慢病毒感染人成熟脂肪細(xì)胞后顯示,當(dāng)MOI值為50時(shí),慢病毒可高效感染成熟脂肪細(xì)胞,且細(xì)胞被感染后狀態(tài)良好。

綜上所述,本研究采用大鼠脂肪基質(zhì)細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化后,用慢病毒可高效感染成熟的脂肪細(xì)胞,為研究脂肪細(xì)胞的基因功能、相關(guān)疾病的基因治療提供了一個(gè)有效工具。

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圖 版 說 明

圖1 第3代脂肪基質(zhì)細(xì)胞表面抗原CD44表達(dá)陽性,細(xì)胞在熒光視野下呈現(xiàn)綠色。FITC標(biāo)記?！?00

圖3 脂肪基質(zhì)細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化后10d。細(xì)胞體積增大,胞內(nèi)有大量大小不等脂滴形成?！?00

圖4 分化后的脂肪細(xì)胞中的脂滴可被油紅O染成紅色。油紅O染色?！?00

圖5A 慢病毒感染分化后的脂肪細(xì)胞。感染96h后細(xì)胞狀態(tài)良好?！?00

圖5B 慢病毒感染分化后的脂肪細(xì)胞。感染96h后,80%細(xì)胞在熒光視野下呈現(xiàn)綠色?！?00

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Expression of cell surface antigen CD44 of adiposederived stromal cells(ADSCs)in generation 3 is positive.Green cells are observed in fluorescence field.FITC labeling.×200

Fig.3 10-d adipogenic differentiation from ADSCs.The cells become larger and there a lots of lipid droplets with inequality of size in cytoplasm.×400

Fig.4 The lipid droplets of differentiated adipocytes showing red color after oil red O staining.×400

Fig.5A Differentiated adipocytes a infected with lentivirus.Phase contrast is examined after 96h,which showing the infected cells were in good condition.×200

Fig.5B Differentiated adipocytes a infected with lentivirus.GFP expression is examined after 96h,and eighty percent of cells showing green color in fluorescence field.×200

EXPERIMENTALSTUDY ON ADIPOGENIC DIFFERENTIATION OF ADIPOSE-DERIVED STROMALCELLS AND LENTIVIRUS INFECTION IN RATS

Liu Li1＊,Ma Shuang1,Gu Hailun2,Ren Yahao1,Yang Jun1
(1Department of Nutrition and Food Hygiene,School of Public Health,China Medical University,Shenyang 110001;2Division of Orthopedics,Shengjing Hospital,China Medical University,Shenyang110004,China)

Objective To induce adipogenic differentiation of rat adipose-derived stromal cells and to observe differentiated adipocytes infected by lentivirus.Methods Cell surface antigen CD44 was identified in rat adipose-derived stromal cells of generation 3 by indirect immunofluorescence miethod,and MTT assay showed the cell growth curve.Then we induced adipogenic differentiation.Oil red O staining were identified Adipocytes differentiated from adipose-dirived stromal cells were identified by oil red O staining, and then were infected by lentivirus.Results Positive expression of cell surface antigen CD44 was found in generation 3.The cell growth curve showed an“S”shape.After 10 adipogenic differentiation of stromal cells,there were many lipid droplets of various sizes in the cytoplas-m.Lipid droplets showed red color after oil red O staining.Lentivirus with GFP reporter can infect differentiated adipocytes.The infection efficiency was about 80%,and infected cells were in good conditions.Conclusion Lentivirus can infect differentiated adipocytes from adipose-derived stromal cells with high efficiency,which perhaps provides a useful tool to study gene function of adipoytes and gene therapy.

Adipose-derived stromal cell;Adipogenic differentiation;Lentivirus;Infection

Q813.11

A

10.3870/zgzzhx.2010.04.002

2010-01-09

2010-03-12

國(guó)家自然科學(xué)基金(30500409)

劉莉,女(1976年),漢族,副教授。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)