萬(wàn)麗丹劉厚奇丁文龍

(1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室,上海200025;2南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室,南昌330006;3第二軍醫(yī)大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室,上海200433)

周圍神經(jīng)損傷后神經(jīng)組織中Par-3蛋白表達(dá)和分布的變化

萬(wàn)麗丹1,2劉厚奇3丁文龍1＊

(1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室,上海200025;2南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室,南昌330006;3第二軍醫(yī)大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室,上海200433)

目的 觀察極性蛋白Par-3在損傷后神經(jīng)組織中的表達(dá)和分布,探討Par-3蛋白在周圍神經(jīng)損傷后髓鞘再生中的作用。方法 32只Sprague Dawley大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、損傷組(坐骨神經(jīng)損傷后第1、2、4、8周)。制備坐骨神經(jīng)擠壓傷模型,分別于損傷后各時(shí)間點(diǎn),采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)坐骨神經(jīng)損傷遠(yuǎn)端Par-3蛋白的表達(dá)和分布。結(jié)果正常大鼠坐骨神經(jīng)組織中即存在Par-3蛋白,但表達(dá)量少,且僅分布于Schwann細(xì)胞核內(nèi)。坐骨神經(jīng)損傷后,Par-3蛋白的表達(dá)和分布發(fā)生變化。損傷后1周,Par-3蛋白表達(dá)開(kāi)始升高,Par-3散在分布于Schwann細(xì)胞核和細(xì)胞漿內(nèi)。損傷后2周,神經(jīng)組織中的Par-3蛋白達(dá)峰值,在Schwann細(xì)胞漿內(nèi)呈不對(duì)稱性分布似包繞軸突,呈新月形或C形。損傷后4周和8周,Par-3蛋白表達(dá)顯著降低,神經(jīng)組織中Par-3蛋白主要分布于Schwann細(xì)胞核內(nèi),胞漿內(nèi)很少。結(jié)論 極性蛋白Par-3可能參與周圍神經(jīng)損傷后Schwann細(xì)胞的髓鞘再生。

周圍神經(jīng)損傷;髓鞘形成;細(xì)胞極性;Par-3

髓鞘的形成有賴于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的兩極分化,這種高度極性化需要細(xì)胞極性蛋白的參與[1,2]。Chan等人[3]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞極性蛋白 Par-3在Schwann細(xì)胞漿內(nèi)面向軸突的不對(duì)稱性分布,是BDNF介導(dǎo)的啟動(dòng)髓鞘形成的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。但是,周圍神經(jīng)損傷后Schwann細(xì)胞中極性蛋白Par-3的表達(dá)和分布的變化,國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)觀察坐骨神經(jīng)損傷后不同時(shí)間點(diǎn),神經(jīng)組織中Par-3蛋白的表達(dá)和分布的變化,明確極性蛋白Par-3與髓鞘再生的關(guān)系,可能為損傷或疾病后的髓鞘形成提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

材料和方法

1.材料

Par-3山羊抗多克隆抗體(1:400)和 FITC結(jié)合的驢抗山羊 IgG抗體(1:1000)購(gòu)自 Santa Cruz公司;驢抗山羊IgG抗體(1:1000)購(gòu)自上海康成生物工程公司;Hochest購(gòu)自Sigma公司;RIPA裂解液購(gòu)自上海生工。倒置相差顯微鏡DMI4000B(Leica公司)。成年雌性Sprague Dawley大鼠(220-240g)32只由中科院上海生命科學(xué)研究院動(dòng)科所提供。

2.坐骨神經(jīng)損傷模型的制作[4]與分組

大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔麻醉后,背部朝上固定于手術(shù)臺(tái)上。右后肢剃毛,75%酒精消毒腿部皮膚,沿大腿外側(cè)作縱切口,暴露臀部肌肉,游離坐骨神經(jīng)(長(zhǎng)約10-15 mm)。使用無(wú)齒止血鉗上一個(gè)扣在坐骨神經(jīng)中上部鉗夾,保持30 sec,在同一位置,止血鉗與前一次垂直再鉗夾30 sec,兩次鉗夾間隔1 min。術(shù)后,逐層縫合右后肢肌肉與皮膚。每只動(dòng)物左后肢未施行手術(shù)作為正常對(duì)照組。動(dòng)物分別飼養(yǎng)1,2,4和8周后取材。大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=32)和損傷組(n=32)。損傷組隨機(jī)分為損傷后1、2、4、8周共4組,每組各8只。免疫組織化學(xué)法染色觀察各組神經(jīng)組織Par-3蛋白的表達(dá)和分布。

3.Western blotting

每組損傷遠(yuǎn)端神經(jīng)組織以RIPA裂解后提取總蛋白,樣品定量后變性處理,經(jīng)聚丙烯酰胺電泳后轉(zhuǎn)膜。TBST洗膜后用5%無(wú)脂牛奶室溫封閉1 h,再加入Par-3山羊抗多克隆抗體(1:400)室溫孵育2 h。TBST洗去未結(jié)合的多余抗體后,加入驢抗山羊IgG(1:1000)室溫孵育1 h。ECL顯影,定影。GAPDH作為內(nèi)參。每組樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

4.免疫組織化學(xué)法

各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大鼠腹腔麻醉后,經(jīng)左心插管灌注200 ml生理鹽水,繼續(xù)灌注4%多聚甲醛的磷酸緩沖液(p H7.4)200 ml,持續(xù)1.5 h。取雙側(cè)坐骨神經(jīng)損傷遠(yuǎn)端1-2 mm處的神經(jīng)組織,置于20%蔗糖磷酸液中,4°C過(guò)夜,做常規(guī)石蠟切片顯示坐骨神經(jīng)橫切面,免疫組織化學(xué)法顯示神經(jīng)組織中Par-3的表達(dá)和分布。操作過(guò)程如下:1:20正常羊血清用0.3%Triton X-100的TBS稀釋孵育標(biāo)本24h,4°C。山羊抗Par-3抗體(1:200)孵育標(biāo)本48 h,4°C。0.01mol/LPBS洗3次,每次10 min。FITC結(jié)合的驢抗山羊 IgG(1:200)孵育標(biāo)本4 h,37°C,避光。Hoechst染核,熒光封片劑封片,鏡下觀察拍照。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

圖1A顯示正常對(duì)照組及損傷后各時(shí)間點(diǎn),坐骨神經(jīng)組織中Par-3蛋白的表達(dá)情況。與正常組相比,損傷后1,2,4和8周Par-3的表達(dá)均高于正常組(＊P<0.05,＊＊P<0.01,＊＊＊P<0.001,圖1B)。神經(jīng)損傷后各時(shí)間點(diǎn),Par-3的表達(dá)呈現(xiàn)先升高而后迅速下降的趨勢(shì),峰值出現(xiàn)在損傷后2周左右。損傷后期神經(jīng)組織中Par-3的表達(dá)較損傷早期已顯著降低,損傷后8周Par-3的表達(dá)已和正常對(duì)照組基本無(wú)異(P>0.05,圖1B)。

圖1 Par-3蛋白在坐骨神經(jīng)組織中的表達(dá)A.神經(jīng)組織中 Par-3蛋白表達(dá)的 westem blotting結(jié)果。B.各組Par-3蛋白表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。Normal:正常對(duì)照組.IW:損傷后1周.2W:損傷后2周.4W:損傷后4周.8W:損傷后8周.＊＊1Wvs Normal,P<0.01,＊＊＊2Wvs NormalP<0.001,＊4Wvs Normal,P<0.05,8Wvs Normal,P>0.05.Fig.1 The expression of Par-3 protein in the sciatic nervesA.The expression of Par-3 protein in nerve tissues was examined by western blotting;B.The statistical analysis of Par-3 expression in each group.Normal:Normalgroup.1W:One week postinjury.2W:Two weeks postinjury.4W:Four weeks postinjury.8W:Eight weeks postinjury.＊＊1Wvs Normal,P<0.01,＊＊＊2Wvs Normal,P<0.001,＊4Wvs Normal, P<0.05,8Wvs Normal,P>0.05.

圖2 Par-3蛋白在坐骨神經(jīng)組織中的表達(dá)和分布 ×400;1.正常對(duì)照組 2.損傷后1周 3.損傷后2周 4.損傷后4周 5.損傷后8周。A.Par-3的FITC免疫螢光染色。B.Hoechst染核C.融合。Fig.2 The expression and distribution of Par-3 protein in the sciatic nerves×400;1.Normal 2.One week post injury 3.Two weeks post injury 4.Four weeks post injury 5.Eight weeks post injury;A.Par-3 immunofluorescence staining;B.Neuclei dyed by Hoechst;C.Merge

圖2為Par-3蛋白在各組神經(jīng)組織中的分布情況。正常對(duì)照組神經(jīng)組織中顯示 Par-3熒光的Schwann細(xì)胞數(shù)量很少,且只位于Schwann細(xì)胞核內(nèi)(圖2-1A)。損傷后1周和2周,神經(jīng)組織中Par-3熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng),提示 Par-3蛋白表達(dá)增強(qiáng),Schwann細(xì)胞胞漿和胞核內(nèi)均有分布。損傷后1周,Par-3蛋白均勻散在分布于Schwann細(xì)胞胞核和胞漿內(nèi)(圖2-2A)。損傷后2周,Schwann細(xì)胞漿內(nèi)Par-3蛋白的分布呈新月形,C形或S形的不對(duì)稱性分布(圖2-3A),似與軸突接觸或包繞軸突。損傷后4周(圖2-4A)和8周(圖2-5A),神經(jīng)組織中 Par-3的表達(dá)顯著降低,且主要分布于Schwann細(xì)胞核內(nèi),Schwann細(xì)胞漿內(nèi)Par-3的不對(duì)稱性分布顯著減少。損傷后4周對(duì)比損傷后8周,神經(jīng)組織內(nèi)尚存在少量Par-3蛋白呈不對(duì)稱性分布的Schwann細(xì)胞。圖3為Par-3蛋白在單個(gè)視野內(nèi)的分布面積和分布密度的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(＊P<0.05,＊＊＊P<0.001)。

圖3 Par-3蛋白在單個(gè)視野內(nèi)的分布面積和分布密度的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;Normal:正常對(duì)照組.1W:損傷后1周.2W:損傷后2周.4W:損傷后4周.8W:損傷后8周.Fig.3 The statistical analysis of Par-3 distribution area and density within a visual field;Normal:Normal group.1W:One week postinjury.2W:Two weeks postinjury.4W:Four weeks postinjury.8W:Eight weeks postinjury;＊＊＊1Wvs Normal,P<0.001;＊＊＊2Wvs Normal,P<0.001;＊4Wvs Normal,P<0.05;8Wvs Normal,P>0.05.

討 論

極性蛋白Par-3可位于細(xì)胞膜、細(xì)胞核和細(xì)胞漿中[5]。位于Schwann細(xì)胞膜上的Par-3主要參與髓鞘施瑯切跡及paranodal loop處緊密連接的形成,結(jié)合其他連接蛋白保證大分子物質(zhì)在髓鞘內(nèi)的正常分布,避免髓鞘外環(huán)境對(duì)髓鞘內(nèi)部的干擾,維持著髓鞘內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,確保髓鞘的絕緣性以及神經(jīng)沖動(dòng)正確有序的傳導(dǎo)[6]。位于 Schwann細(xì)胞漿中的Par-3就像一個(gè)分子支架,將形成髓鞘所需的關(guān)鍵蛋白質(zhì)集合起來(lái),同時(shí)這個(gè)支架還是軸突信號(hào)的受體[3]。Schwann細(xì)胞必須形成極性,才能判斷細(xì)胞的哪一側(cè)和軸突接觸了,而Par-3是Schwann細(xì)胞極性化的分子基礎(chǔ)。當(dāng)這個(gè)支架被打亂后,細(xì)胞就不能形成正常的髓鞘[3]。

本實(shí)驗(yàn)中,損傷早期,Par-3蛋白強(qiáng)表達(dá),同時(shí)分布于Schwann細(xì)胞胞漿和胞核內(nèi)。損傷晚期, Par-3蛋白表達(dá)明顯減少,基本只位于Schwann細(xì)胞核內(nèi)。損傷后2周,Schwann細(xì)胞漿內(nèi)Par-3蛋白的分布尤其特別,呈不對(duì)稱性分布,似與軸突接觸或包繞軸突。由于髓鞘形成是Schwann細(xì)胞變形,包繞軸突的過(guò)程,因此我認(rèn)為胞漿內(nèi)Par-3蛋白分布的變化是Schwann細(xì)胞極性化以及髓鞘形成的關(guān)鍵,而胞核內(nèi)Par-3的存在,可能是一種蛋白儲(chǔ)備,一旦軸突脫髓鞘,胞核內(nèi)的Par-3即被動(dòng)員出來(lái),移至胞漿。Par-3蛋白表達(dá)和分布的變化可能是由于Schwann細(xì)胞感受到與軸突失去聯(lián)系,通過(guò)某種胞內(nèi)信號(hào)通路,上調(diào)Par-3的表達(dá),還促使Par-3由胞核向胞漿轉(zhuǎn)移。離體實(shí)驗(yàn)[3]表明單純培養(yǎng)的Schwann細(xì)胞,胞漿內(nèi)Par-3彌散分布,或在相鄰Schwann細(xì)胞的接觸部位呈線形分布,不呈新月形或C形分布。因此,Par-3蛋白從胞核運(yùn)至胞漿后是否在胞漿呈不對(duì)稱性分布,必須以Schwann細(xì)胞是否接觸到軸突為前提。本實(shí)驗(yàn)中,損傷后1周,大部分再生軸突尚未穿過(guò)損傷部位到達(dá)損傷遠(yuǎn)端,Schwann細(xì)胞漿內(nèi)Par-3蛋白在胞漿和胞核內(nèi)分布均勻,無(wú)極性,不對(duì)稱性分布尚不明顯。損傷后2周,軸突再生并跨越損傷部位達(dá)到損傷遠(yuǎn)端,Par-3蛋白同時(shí)存在于胞核和胞漿內(nèi),并在胞漿內(nèi)呈不對(duì)稱性分布。但是,盡管損傷后4周和8周,損傷遠(yuǎn)端存在軸突,Par-3蛋白的這種不對(duì)稱性分布卻未觀察到。初步判斷極性蛋白Par-3對(duì)于Schwann細(xì)胞啟動(dòng)成髓,即Schwann細(xì)胞識(shí)別軸突后進(jìn)行第一層包繞,至關(guān)重要。一旦Schwann細(xì)胞完成了對(duì)髓鞘的第一層包繞,Par-3將迅速返回胞核內(nèi)。而剩余的同心圓性包繞,可能是一種慣性,這種慣性至少包含了細(xì)胞骨架的不斷延伸,及Schwann細(xì)胞相鄰胞膜間緊密連接的共同維持,至少主要不是由Par-3在Schwann細(xì)胞和軸突相鄰面形成的支架來(lái)維持的。當(dāng)然,維持髓鞘形成也包含了各類與髓鞘形成有關(guān)的物質(zhì)如髓鞘蛋白和膜脂質(zhì)的不斷合成。不得不提的是,本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型為坐骨神經(jīng)擠壓傷,損傷程度較輕,因此觀察周數(shù)較短,Par-3蛋白在Schwann細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)不對(duì)稱性分布的時(shí)間點(diǎn)為損傷后2周左右。但是,對(duì)于其他不同類型和程度的周圍神經(jīng)損傷后的髓鞘再生,Schwann細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)Par-3不對(duì)稱性分布的時(shí)間點(diǎn)或許會(huì)不同于本實(shí)驗(yàn)顯示的結(jié)果,這種區(qū)別主要由于不同損傷后再生軸突跨越損傷部位所需的時(shí)間不同。

Par-3蛋白在Schwann細(xì)胞漿內(nèi)呈極性分布的意義可能在于,當(dāng)神經(jīng)組織中存在高濃度BDNF時(shí),牽引Schwann細(xì)胞膜表面的p75NTR向高濃度BDNF趨向性轉(zhuǎn)移,通過(guò)結(jié)合于Par-3的PDZ區(qū), p75NTR被固定于 Schwann細(xì)胞膜面向軸突的那一側(cè),形成了p75NTR-Par-3復(fù)合體在 Schwann細(xì)胞的極性分布。通過(guò)該復(fù)合體,Schwann細(xì)胞可準(zhǔn)確感受與之相接觸的軸突所釋放BDNF水平的高低,并對(duì)此作出適應(yīng)性反應(yīng),最終表現(xiàn)不斷合成與髓鞘形成有關(guān)的一系列物質(zhì),這一推論有望在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)。另外,其他神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在髓鞘形成與損傷后的髓鞘再生中發(fā)揮重要作用[7,8],它們與Schwann細(xì)胞中 Par-3的表達(dá)與分布之間的關(guān)系也值得深入探討。

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EXPRESSION AND DISTRIBUTION OF PAR-3 PROTEIN IN PERIPHERALNERVE TISSUES AFTER INJURY

Wan Lidan1,2＊,Liu Houqi3,Ding Wenlong1＊
(1Department of A natomy,School of Medicine,S hanghai J iaotong University,S hanghai200025;2Department of A natomy,Medical School,N anchang University,N anchang330006;3Department ofHistology and Embryology,The Second Military Medical University,Shanghai200433,China)

Objective To observe the expression and distribution of the polarity protein Par-3 in nerve tissues after peripheral nerve injury,and to investigate the role of Par-3 protein in Schwann cell myelination.Methods 32 Sprague-Dawley rats were randomly divided into a control group and experimental groups,the latter was subdivided into 1,2,4 and 8-week groups after sciatic nerve injury.The expression and distribution of Par-3 in sciatic nerve tissues distal to the injury site was examined by using immunohistochemistry.Results Par-3 protein existed in the normal sciatic nerve tissues,but in small quantities,and only localized in Schwann cell nucleus.After sciatic nerve injury,the expression and distribution of Par-3 protein changed.At 1 week post injury,Par-3 protein in Schwann cells began to increase,scattered in both the nucleus and the cytoplasm within Schwann cells.At 2 weeks post injury,Par-3 protein reached a peak expression and was asymmetrically distributed in the cytoplasm within Schwann cells surrounding axons,exhibiting a half-moon or C-shape.At 4 and 8 weeks post injury,the expression of Par-3 protein was markedly reduced,mainly found in Schwann cell nucleus,but rarely in the cytoplasm.Conclusion Our findings suggest that the polarity protein Par-3 may play a role in Schwann cell remyelination after peripheral nerve injury.

Peripheral nerve injury;Myelination;Cell polarity;Par-3

R322.85

A

10.3870/zgzzhx.2010.04.004

2010-01-15

2010-04-20

上海市重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(S30201)南昌大學(xué)博士科研基金。

萬(wàn)麗丹,女(1980年),漢族,博士,講師

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)