宋 楠 楊曉鳳

(解放軍四六三醫(yī)院細胞治療中心,遼寧沈陽110042)

假肥大型肌營養(yǎng)不良肌細胞抗肌萎縮蛋白的免疫組化研究

宋 楠 楊曉鳳＊

(解放軍四六三醫(yī)院細胞治療中心,遼寧沈陽110042)

目的 研究假肥大型肌營養(yǎng)不良患者肌細胞中抗肌萎縮蛋白(dystrophin)的表達及其診斷意義。方法 應用針吸型活檢術取121例假肥大型肌營養(yǎng)不良癥患者(108例DMD患者,13例BMD患者)的肌組織,采用HE染色觀察被檢肌肉病理改變,免疫組織化學染色技術檢測抗肌營養(yǎng)不良蛋白表達,以正常人肌細胞作為對照。結果 正常人肌細胞膜上抗肌營養(yǎng)不良蛋白染色陽性,呈完整環(huán)形條帶沿肌細胞膜分布;DMD患者肌膜完全無顯色;BMD患者染色弱陽性,可見沿肌細胞膜分布的間斷表達。結論 應用針吸型活檢技術和免疫組化染色法檢測抗肌營養(yǎng)不良蛋白,有助于DMD和BMD確診及鑒別診斷。

假肥大肌營養(yǎng)不良;免疫組化;抗肌萎縮蛋白

假肥大型肌營養(yǎng)不良是常見肌肉系統(tǒng)X連鎖隱性遺傳病,表現(xiàn)為進行性肌肉萎縮,發(fā)病者多為男性,分為 Duchenne型和 Becker型(DMD/ BMD)。本病主要是由于位于染色體Xp21.2肌細胞膜上的抗肌萎縮蛋白(dystrophin)基因缺失所致該蛋白的缺失或表達異常[1],因此檢測dystrophin有助于疾病診斷和分類。我們針對從2009年5月起治療108例DMD和13例BMD患者,首次應用改良式針吸型活檢術取患者肌肉進行形態(tài)學觀察和抗dystrophin免疫組化研究,現(xiàn)將結果報告如下。

材料和方法

1.病例來源

收集解放軍463醫(yī)院細胞治療中心住院的108例男性DMD患者和13例BMD患者資料,均經(jīng)臨床癥狀、肌電圖、血清酶譜和核磁共振等確診。對照組為正常人肌肉組織。

2.材料及試劑:抗dystrophin抗體購自Santa Cruz公司,SP試劑盒及DAB顯色劑均購自福州邁新生物技術公司,TZ半自動活檢槍購自北京德邁特貿(mào)易有限公司。

3.檢測方法

3.1 冰凍切片制備:應用針吸型活檢術吸取患者股四頭肌,經(jīng)OCT包埋劑包埋,液氮驟冷,置入恒冷式冰凍切片機切片,厚度均為8μm。

3.2 HE染色:切片經(jīng)甲醇固定,蘇木素染色5min,鹽酸酒精分化后反藍 15min,伊紅染色3min,經(jīng)梯度酒精、二甲苯后中性樹膠封片。光鏡下觀察結果。

3.3 免疫組織化學染色

免疫組化檢測 dystrophin蛋白的表達:切片經(jīng)甲醇固定,3%H2O2溶液抑制內(nèi)源性過氧化物酶,PBS洗滌3min×3次;用5%的正常羊血清于室溫下封閉非特異性抗原20min;一抗用dystrophin抗體(1:100稀釋),放入濕盒內(nèi)4℃冰箱過夜;第二天用 PBS洗滌3min×3次,滴加二抗,室溫孵育20min。用PBS代替一抗作為陰性對照,以正常人的肌組織切片作為陽性對照。顯色,脫水,封片觀察。

結果判定:dystrophin陽性反應位于細胞膜,呈棕黃色為陽性,不著色為陰性。

結 果

1.正常對照組:正常肌肉HE染色顯示肌纖維大小均勻,呈網(wǎng)格狀排列,核位于肌纖維的周邊(圖1)。免疫組化結果可見肌細胞膜上出現(xiàn)強度均勻一致棕黃色完整環(huán)狀條帶,為 dystrophin陽性表達(圖4)。

2.DMD組:108例DMD患者肌纖維HE染色顯示肌纖維大小不等,外形變圓,萎縮和肥大肌纖維并存,大量細胞核內(nèi)移,其間纖維組織增生,脂肪組織浸潤(圖2)。免疫組化結果顯示肌細胞膜均無著色,為dystrophin陰性(圖5)。

3.BMD組:13例BMD患者肌纖維HE染色顯示肌纖維同樣存在大小不等,細胞核內(nèi)移,但纖維組織增生和脂肪組織浸潤的程度較DMD組輕(圖3)。免疫組化結果顯示肌細胞膜上棕黃色顆粒狀間斷出現(xiàn),強度不一致,部分存在,呈斑片狀分布(圖6)。

圖1 正常人肌肉組織HE染色(×400),肌纖維大小均勻,呈網(wǎng)格狀排列;圖2 DMD患者肌肉組織 HE染色(× 400),肌纖維明顯萎縮,少部分肥大,其外形變圓,細胞核內(nèi)移,其間大量的纖維增生;圖3 BMD患者肌肉組織 HE染色(×400),肌纖維萎縮與肥大并存,細胞核內(nèi)移,其間存在纖維增生;圖4正常人肌肉組織冰凍切片dystrophin免疫組化染色(×400),dystrophin蛋白陽性,肌細胞膜上可見完整的環(huán)形條帶;圖5;DMD患者肌肉組織冰凍切片dystrophin免疫組化染色(×400),dystrophin蛋白陰性;圖6 BMD患者肌肉組織冰凍切片dystrophin免疫組化染色(×400),dystrophin蛋白陽性,強度不均一,間斷表達Fig.1 The HE staining of the muscular biopsy in the normal males(×400).The muscular fibers have similar size with grid-like arrangement;Fig.2 The HE staining of the muscle biopsy in the DMD patients(×400).There are a lot of muscular fibers showing obviously atrophy,some showing hypertrophy with central location of nucleus and proliferating fibrous tissue;Fig.3 The HE staining of the muscle biopsy in the BMD patients(×400).There is coexistence of atrophy and hypertrophy muscular fibers.Some muscular fibers have central location of nucleus;Fig.4 The immunohistochemical staining of the muscle biopsy in the normal males(×400).There is dystrophin protein expression in the muscular fibers and showing a complete circle strip in cell membrane.Fig.5 The immunohistochemical staining of the muscle biopsy in the DMD patients(×400), showing negative dystrophin protein expression in the muscles of the DMD patients.Fig.6 The immunohistochemical staining of the muscle biopsy in the BMD patients(×400),showing discontinuous dystrophin expression in the most musular fibers.

討 論

假肥大型肌營養(yǎng)不良是一種常見肌肉系統(tǒng) X連鎖隱性遺傳病,Duchenne型和Becker型為其中最常見兩種分型。兒童以Duchenne型為多見。臨床上患者多出現(xiàn)雙下肢和四肢近端開始的肌無力、四肢近端肌萎縮、雙腓腸肌假性肥大,血清肌酶升高、肌電圖肌源性損害等特征性表現(xiàn)。Becker型肌營養(yǎng)不良為良性型肌營養(yǎng)不良癥。發(fā)病年齡較小,癥狀較輕,預后較好。雖然兩種病癥狀不太一樣,但是發(fā)病機制都是由于 dystrophin基因的缺陷導致蛋白表達減少或消失造成。DMD或BMD疾病發(fā)生與肌細胞膜上dystrophin表達狀況直接相關[2]。當肌細胞膜上 dystrophin完全缺失時,患者病情嚴重,為DMD;當dystrophin部分缺失時,患者病情較輕,為BMD[3]。肌肉活檢是進行性肌營養(yǎng)不良確診重要方法[4],因此,檢測dystrophin非常有助于疾病診斷分型和研究。但是,由于患者大多為兒童,肌肉活檢長時間來不便廣泛開展。本研究中應用了針吸型活檢技術進行免疫組化檢測減輕了患者的痛苦,有利于Duchenne型和Becker型肌營養(yǎng)不良的確診和鑒別診斷。雖然國內(nèi)外都有應用免疫組化方法診斷該病,但是改良針吸式活檢技術運用和大樣本的檢測,在國內(nèi)外均為首次報道。

本研究結果顯示在正常人肌肉中,dystrophin表達強度均一,位于細胞膜上,此為 dystrophin正常表達。此時可見肌細胞形態(tài)與結構均正常。在DMD患者的肌肉中,細胞膜上沒有出現(xiàn)dystropohin表達,為 dystropohin缺失,因其是維持肌細胞形態(tài)重要因素,所以肌細胞形態(tài)出現(xiàn)萎縮和肥大,符合臨床癥狀和其它各種檢測結果。BMD患者肌肉檢測中dystrophin在肌細胞膜上間斷表達,強度不均一,這是由于 dystrophin的部分缺陷造成。閱讀框架學說解釋了DMD和BMD表型不同的原因。如果基因缺失破壞了開放閱讀框,導致了dystrophin蛋白截斷,造成dystrophin含量不足正常人3%,陰性表達,形成癥狀嚴重DMD表型;若基因缺失未破壞開放閱讀框,經(jīng)翻譯產(chǎn)生的dystrophin長度縮短,可維持部分功能,因而表現(xiàn)為較輕臨床癥狀BMD表型[5]。DMD和BMD患者肌細胞形態(tài)改變是因為基因突變造成細胞膜上dystrophin蛋白缺失破壞了細胞骨架,從而使得細胞膜不穩(wěn)定,不能抵抗肌纖維的舒縮牽拉而損傷[6,7];另外,細胞膜通透性改變,使得細胞內(nèi)鈣濃度增加,激活了胞漿中鈣蛋白酶[8],增加了對蛋白降解,加速了細胞膜破壞,導致肌纖維斷裂、變性、壞死[9]。

綜上所述,Dystrophin基因是目前已知人類最大的基因,由于其結構復雜,且有很高突變率,給檢測帶來很大困難,基因診斷等技術也有其局限性,而dystrophin缺失是DMD和BMD基本病理基礎,不論 dystrophin基因有何種突變,絕大部分DMD患者存在dystrophin缺陷,檢測dystrophin表達為DMD診斷提供了準確而簡便的手段[10]。因此,運用針吸型活檢術和免疫組化方法檢測dystrophin蛋白表達不但使得DMD和BMD的診斷成為可能,更為臨床表現(xiàn)有重疊,不易鑒別肌營養(yǎng)不良其他類型和某些代謝性肌病診斷和鑒別提供了重要的依據(jù)。

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IMMUNOHISTOCHEMICALSTUDY OF THE DYSTROPHIN EXPRESSION OF MUSCLE CELLS IN PATIENTS WITH PSEUDOHYPERTROPHIC MUSCULARDYSTROPHY

Song Nan,Yang Xiaofeng＊
(The463Hospital ofPeople′s Liberation A rmy,S henyang110042,China)

Objective To study the expression and diagnotic significance of dystrophin of muscle cells in patients with pseudohypertrophic muscular dystrophy.Methods The muscle specimens were obtained from 121 patients(108 DMD and 13 BMD)with pseudohypertrophic muscular dystrophy by using needle biopsy.The sections were treated with HE stain,and the pathological changes were observed.Dystrophin in muscle cells was detected by immunohistochemical technique and compared with normal muscle.Results The normal muscle showed ringed positive staining stripes around muscle cells.Negative result of staining was seen in 108 cases of DMD.The discontinuous positive staining was showed in 13 BMD.Conclusion Detecting dystrophin in muscles cells by needle biopsy and immunohistochemical technique is an efficient method for diagnosising and distinguishing DMD/BMD.

Pseudohypertrophic muscular dystrophy;Immunohistochemistry;Dystrophin

R446.8

A

10.3870/zgzzhx.2010.04.014

2010-02-10

2010-04-01

宋楠,女(1980年),漢族,住院醫(yī)師。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)