付文亮 鐘美蓉 和亞強(qiáng) 宋成軍 陳志宏

(承德醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室,河北 067000)

絲膠預(yù)處理對(duì)糖尿病大鼠睪丸IGF-1表達(dá)的影響

付文亮 鐘美蓉 和亞強(qiáng) 宋成軍 陳志宏＊

(承德醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室,河北 067000)

目的 探討絲膠預(yù)處理對(duì)2型糖尿病大鼠睪丸胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)表達(dá)的影響。方法 30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組(n=10):正常對(duì)照組、糖尿病模型組和絲膠預(yù)處理組。鏈脲佐菌素連續(xù)腹腔注射制作2型糖尿病大鼠模型,以血糖≥16.7mmol/L作為成模標(biāo)準(zhǔn);絲膠預(yù)處理組大鼠在注射鏈脲佐菌素前給予絲膠灌胃(2.4g/kg/d)35d。采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)血糖,采用ELISA方法檢測(cè)大鼠血清睪酮和IGF-1水平;分別采用免疫組化染色和RT-PCR法檢測(cè)睪丸IGF-1蛋白和mRNA的表達(dá)。結(jié)果 絲膠預(yù)處理可明顯抑制糖尿病大鼠血糖升高,血清睪酮、IGF-1水平的降低,睪丸IGF-1表達(dá)的下降(絲膠預(yù)處理組與糖尿病模型組比較:P<0.01)。結(jié)論 絲膠預(yù)處理可通過阻止糖尿病大鼠睪丸IGF-1表達(dá)的下調(diào),改善生精功能,發(fā)揮對(duì)糖尿病生殖功能損害的預(yù)防保護(hù)作用。

絲膠;糖尿病;睪丸;胰島素樣生長因子-1;預(yù)處理

胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)是由70個(gè)氨基酸組成的多肽,在結(jié)構(gòu)上與胰島素有高度的同源性,除了介導(dǎo)生長激素的作用外,對(duì)代謝有著類胰島素樣作用[1-2]。最初的研究發(fā)現(xiàn),IGF-1由肝臟合成和分泌;目前,在腎、肺、胸腺、睪丸和腦等多種器官也發(fā)現(xiàn)有IGF-1的存在[3]。IGF-1與雄性生殖密切相關(guān),可通過下丘腦-垂體-睪丸軸的各個(gè)層面發(fā)揮對(duì)雄性內(nèi)分泌功能的調(diào)控作用;IGF-1基因突變的雄性小鼠出現(xiàn)身體、中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常以及生殖器官發(fā)育遲緩和生殖功能減退[4]。絲膠約占蠶繭的30%,是繭絲中具有多種生物活性的水溶性蛋白質(zhì),本文觀察了絲膠預(yù)處理對(duì)2型糖尿病大鼠睪丸IGF-1表達(dá)的影響,為防治糖尿病生殖功能減退開辟新思路。

材料和方法

1.材料

絲膠為彩色蠶繭經(jīng)浸泡、水煎、過濾、濃縮而成。鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ),美國Sigma公司;檢測(cè)血清睪酮的 ELISA試劑盒,武漢中美科技有限公司;檢測(cè)血清 IGF-1的 ELISA試劑盒,武漢博士德生物工程公司;兔抗IGF-1多克隆抗體,武漢博士德生物工程有限公司;Trizol,美國 Invitrogen公司;IGF-1引物由上海生工公司合成;一步法RT-PCR試劑盒,大連寶生物工程有限公司;藍(lán)色預(yù)染蛋白質(zhì)Marker(低)、600bp DNA Ladder,北京泰格美科技有限公司。

2.方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組及處理 清潔級(jí)雄性SD大鼠30只,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào):712024),體重 200-250g。將大鼠隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組、糖尿病模型組和絲膠預(yù)處理組,每組均為10只。采用2%STZ(25mg/ kg,3d)連續(xù)腹腔注射建立糖尿病動(dòng)物模型,一周后以血糖≥16.7mmol/L作為成模標(biāo)準(zhǔn);絲膠預(yù)處理組大鼠在注射STZ前給予絲膠(2.4g/kg/d)灌胃35d。

2.2 血液指標(biāo)的檢測(cè) 各組大鼠用藥結(jié)束后禁食12h以上,4%水合氯醛腹腔注射麻醉,經(jīng)內(nèi)眥采血,3000r/min離心20min,收集血清;采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)血糖,采用 ELISA方法檢測(cè)睪酮和IGF-1水平。

2.3 睪丸IGF-1表達(dá)的檢測(cè) 大鼠取血后斷頭處死,迅速取出雙側(cè)睪丸,一側(cè)睪丸入Bouins液固定,另一側(cè)睪丸入液氮速凍保存。

2.3.1 免疫組織化學(xué)染色及定量分析:入Bouins液固定睪丸,常規(guī)石蠟包埋,Leica石蠟切片機(jī)連續(xù)切片,片厚5μm。免疫組化染色觀察睪丸IGF-1蛋白(一抗1:50)的表達(dá),DAB顯色,蘇木素復(fù)染,常規(guī)脫水、透明、封片。陰性對(duì)照以PBS代替一抗。以細(xì)胞核和/或細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒或棕褐色顆粒為陽性反應(yīng)。定量分析:每組選取5只大鼠的睪丸,每個(gè)標(biāo)本選取3張切片,每張切片在10×40倍顯微鏡下,隨機(jī)選取組織結(jié)構(gòu)保存較好的精曲小管,應(yīng)用MiVnt圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析,以免疫陽性產(chǎn)物面積占視野面積的比值作為IGF-1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平,取平均值。

2.3.2 RT-PCR法檢測(cè)睪丸 IGF-1 mRNA的表達(dá):取100mg睪丸組織,在液氮中碾磨成粉末,按Trizol總RNA抽提說明書操作,提取睪丸組織的總 RNA。取 3μg總 RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,反 應(yīng) 條 件 為:30℃,10min;55℃, 30min;99℃,5min;5℃,5min。PCR反應(yīng)條件:94℃,2min;94℃,30s;50℃-65℃,30s;72℃,1min,第二步起循環(huán)。PCR引物序列及擴(kuò)增條件見表1。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳(含0.5mg/LGoldview),采用ZF型紫外透射反射分析儀攝像,并用 Quantity One-4.6.2軟件進(jìn)行定量分析,以目的條帶的光密度與β-actin條帶光密度的比值,作為IGF-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 PCR引物序列及擴(kuò)增條件Table 1 Primers and amplification condition of PCR

2.4 統(tǒng)計(jì)分析

結(jié) 果

1.大鼠血糖 結(jié)果見表2。糖尿病模型大鼠血糖明顯高于正常大鼠(P<0.01);絲膠預(yù)處理可明顯抑制糖尿病大鼠血糖水平的升高,絲膠預(yù)處理組大鼠血糖明顯低于模型大鼠(P<0.01)。

2.大鼠血清睪酮和IGF-1水平 結(jié)果見表2。糖尿病模型大鼠血清睪酮和IGF-1水平明顯低于正常大鼠(P<0.01);絲膠可明顯抑制糖尿病模型大鼠血清睪酮和IGF-1水平的下降:絲膠預(yù)處理組大鼠血清睪酮和IGF-1水平明顯高于糖尿病模型大鼠(P<0.01)。

表2 大鼠血清睪酮和IGF-1水平(±s)Table 2 Testosterone and IGF-1 level in serum of rats(±s)

表2 大鼠血清睪酮和IGF-1水平(±s)Table 2 Testosterone and IGF-1 level in serum of rats(±s)

vsdiabetes model group,＊P<0.01

?

3.大鼠睪丸IGF-1蛋白的表達(dá) 各組大鼠睪丸切片均可見IGF-1蛋白免疫陽性染色。IGF-1蛋白免疫陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒狀和棕褐色顆粒狀,位于間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞胞漿,及初級(jí)精母細(xì)胞胞核(圖1)。IGF-1蛋白定量分析結(jié)果見表3:與正常對(duì)照組大鼠比較,糖尿病模型組大鼠睪丸IGF-1蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.01);絲膠預(yù)處理組大鼠睪丸IGF-1蛋白的表達(dá)明顯高于糖尿病模型組大鼠(P<0.01)。

4.大鼠睪丸IGF-1 mRNA的表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示,在280 bp處可見清晰的IGF-1 mRNA條帶(圖2);在445bp處可見清晰的β-actin mRNA條帶(圖3)。IGF-1 mRNA定量分析結(jié)果見表3:與正常對(duì)照組大鼠比較,糖尿病模型組大鼠睪丸IGF-1 mRNA的表達(dá)明顯降低(P<0.01);絲膠預(yù)處理組大鼠睪丸IGF-1 mRNA的表達(dá)明顯高于糖尿病模型組大鼠(P<0.01)。

圖1 睪丸IGF-1蛋白的表達(dá)(×200).A:正常組,B:模型組,C:絲膠預(yù)處理組Fig.1 IGF-1 protein expression in testes(×200).A:Normal control group,B:Diabetes model group,C:Sericine pretreatment group.

表3 各組大鼠睪丸IGF-1的表達(dá)(±s)Table 3 IGF-1 expression in testes of rats in each group(±s)

表3 各組大鼠睪丸IGF-1的表達(dá)(±s)Table 3 IGF-1 expression in testes of rats in each group(±s)

vsdiabetes model group,＊P<0.01

Group IGF-1proteinIGF-1mRNANormal control group 0.1069±0.0117＊0.8519±0.1473＊Diabetes model group 0.0357±0.1262 0.3595±0.0771 Sericine pretreatment group 0.0928±0.0091＊0.7088±0.0734＊

討 論

循環(huán)中的IGF-1主要來源于肝臟,其合成受生長激素、胰島素和營養(yǎng)狀況等的調(diào)節(jié)[5]。研究表明,1型和2型糖尿病患者,普遍存在IGF-1水平的降低,原因是長期高血糖引起肝臟生長激素抵抗,使生長激素促進(jìn)IGF-1合成的作用喪失;高血糖及胰島素缺乏本身也可直接抑制IGF-1的合成;糖尿病時(shí)三大物質(zhì)代謝紊亂及糖尿病患者長期飲食控制,潛在營養(yǎng)不良,使IGF-1的清除與降解水平增加[6]。

睪丸內(nèi)支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及初級(jí)精母細(xì)胞均有IGF-1表達(dá),且睪丸間質(zhì)細(xì)胞及其它睪丸組織存在IGF-1受體。在睪丸內(nèi)IGF-1以自分泌和/或旁分泌的方式發(fā)揮作用,影響生殖功能:IGF-1作為睪丸間質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞的促有絲分裂因子,通過增加類固醇激素合成酶的表達(dá)和調(diào)控睪酮的生物合成,調(diào)節(jié)間質(zhì)細(xì)胞的生長發(fā)育,促進(jìn)雄性激素分泌[7];IGF-1對(duì)青春期前的支持細(xì)胞有增殖作用,并可維持初級(jí)精母細(xì)胞DNA的合成,有研究認(rèn)為IGF-1調(diào)節(jié)支持細(xì)胞功能的作用是通過PI3K/PKB通路實(shí)現(xiàn)的[8];另外,IGF-1還可以促進(jìn)精子獲能和頂體反應(yīng),提高精子活力和促進(jìn)精子發(fā)生[9]。

本研究發(fā)現(xiàn),糖尿病模型大鼠睪丸IGF-1的表達(dá)明顯降低,引起睪酮分泌水平下降、生精能力減弱及精子活動(dòng)能力下降,糖尿病大鼠出現(xiàn)明顯的生殖功能減退。目前,糖尿病生殖障礙的發(fā)病率是其它人群的5-10倍,給患者的身心健康帶來嚴(yán)重的傷害和困擾,隨著糖尿病發(fā)病率的升高及發(fā)病年齡的降低,糖尿病并發(fā)的生殖損傷越來越受到社會(huì)的極大關(guān)注,因此探尋防治糖尿病生殖功能障礙的藥物顯得尤為重要。絲膠是彩色蠶繭經(jīng)浸泡、水煎、過濾、濃縮而成,為蠶繭中溶于水的高分子蛋白質(zhì),具有多種生物活性,民間有蠶繭泡水降血糖的驗(yàn)方。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn),絲膠可有效降低血糖及提高糖尿病模型大鼠睪丸生精細(xì)胞的增殖能力[10-11]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),絲膠預(yù)處理可明顯抑制糖尿病大鼠血清睪酮、IGF-1水平的下降及睪丸IGF-1表達(dá)的降低;表明絲膠預(yù)處理可通過抑制睪丸IGF-1表達(dá)的下調(diào),防止糖尿病時(shí)睪酮分泌水平下降、生精能力減弱及精子活動(dòng)能力降低,因此絲膠預(yù)處理可較好防止糖尿病生殖功能損傷的發(fā)生。目前,臨床上多用西藥控制血糖,而絲膠是天然的蛋白質(zhì),可避免化學(xué)合成藥物所產(chǎn)生的毒副作用;但絲膠預(yù)處理防止睪丸損傷的機(jī)制,是由于降低血糖的繼發(fā)作用、還是絲膠的直接作用,有待于進(jìn)一步的深入探討。

[1]Anisimov VN.Role of the growth hormone-insulin-like growth factor-1-insulin system signaling in aging and longevity:evolutional aspect.Ross Fiziol Zh Im I M Sechenova,2008,94(9):1092-1109

[2]Butler AE,Janson J,Bonner-Weir S,et al.Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes.Diabetes,2003,52(1):102-110

[3]Thum T,Hoeber S,Froese S,et al.Age-dependent impairment of endothelial progenitor cells is corrected by growth-hormone-mediated increase of insulin-like growth-factor-1.Circ Res,2007,100(3):434-443

[4]Richards RG,Klotz DM,Walker MP,et al.Mammary gland branching morphogenesis is diminished in mice with a deficiency of insulin-like growth factor-I(IGF-I), but not in mice with a liver-specific deletion of IGF-I.Endocrinology,2004,45(7):3106-3110

[5]Very NM,Kittilson JD,Klein SE,et al.Somatostatin inhibits basal and growth hormone-stimulated hepatic insulin-like growth factor-I production.Mol Cell Endocrinol,2008,281(1-2):19-26

[6]Han HJ,Park SH.Alteration of the gene and protein levels of insulin-like growth factors in streptozotocin-induced diabetic male rats.J Vet Med Sci,2006,68(5): 413-419

[7]Berensztein EB,Baquedano MS,Pepe CM,et al.Role of IGFs and insulin in the human testis during postnatal activation:differentiation of steroidogenic cells.Pediatr Res,2008,63(6):662-666

[8]Meroni SB,Riera MF,Pellizzari EH,et al.FSH activates phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B signaling pathway in 20-day-old Sertoli cells independently of IGF-I.J Endocrinol,2004,180(2):257-265

[9]Minelli A,Moroni M,Castellini C,et al.Isolation and purification of the IGF-1 protein complex from rabbit seminal plasma:Effects on sperm motility and viability.J Exp Zool,2001,290(3):279-290

[10]付秀美,馬寶君,趙立軍,等.絲膠對(duì)2型糖尿病大鼠血糖的影響.承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,25(4): 351-353

[11]付文亮,和亞強(qiáng),付秀美,等.絲膠對(duì)2型糖尿病大鼠睪丸生精細(xì)胞 PCNA表達(dá)的影響.承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,26(4):353-356

EFFECTS OF SERICINE PRETREATMENT ON IGF-1 EXPRESSION IN TESTES OF DIABETES MELLITUS RAT MODEL

Fu Wenliang,Zhong Meirong,He Yaqiang,Song Chengjun,Chen Zhihong＊
(Department of A natomy,Chengde Medical College,Hebei067000,China)

Objective To study the effects of sericine pretreatment on the expression of insulin-like growth factor-1(IGF-1)in testes of type 2 diabetes mellitus rat model.Methods 30 male SD rats were randomly divided into 3 groups(n=10):normal control group,diabetes model group and sericine pretreatment group.The type 2 diabetes model was induced by continuous intraperitoneal injection of streptozotocin,and blood glucose≥16.7mmol/Lwas taken as standard.The rats in sericine pretreatment group were lavaged with sericine(2.4g/kg/d)for 35 days before injecting streptozotocin.Glucose oxidase method was used to detect blood glucose of rats in each group,ELISA was used to detect testosterone and IGF-1 level in the serum,immunohistochemical staining and RT-PCR were respectively used to detect the expression of IGF-1 protein and mRNA in testes.Results Sericine pretreatment significantly inhibited increasing of blood glucose,decreasing of testosterone and of IGF-1 level in the serum,and inhibited descending of IGF-1 expression in testes(sericine pretreatment group compared with model group:P<0.01).Conclusion Sericine pretreatment has preventive effects on reproductive dysfunction of diabetic rats,improving the spermatogenic function by preventing the down-regulation of IGF-1 expression in testes.

Sericine;Diabetes;Testis;IGF-1;Pretreatment

R587.1

A

10.3870/zgzzhx.2010.04.010

2010-01-30

2010-04-20

河北省教育廳項(xiàng)目(2006301),河北省科技廳項(xiàng)目(08276101D-19)

付文亮,男(1983年),漢族,碩士研究生。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)