邢洪存 郭芳芳 盧振霞*

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生可能由癌基因的激活、抑癌基因的失活引起，也可能是細胞凋亡異常的結(jié)果[1-4]。Survivin是迄今發(fā)現(xiàn)最強的凋亡抑制因子，屬于凋亡抑制蛋白（Inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族成員[5,6]。研究表明，Survivin選擇性地表達于腫瘤組織，而在正常成熟組織中不表達或很少表達[7-9]。本研究旨在通過檢測Survivin在結(jié)直腸癌組織中的表達情況，探討其與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展和預后的關系。

1 材料與方法

1.1 病例資料

標本取自2003年8月至2005年10月在吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院及吉林省腫瘤醫(yī)院腹科住院行根治性手術的58例原發(fā)性結(jié)直腸癌患者。所有標本均經(jīng)嚴格篩選及2名以上醫(yī)師進行病理診斷，術前均未經(jīng)化療、放療或免疫治療。其中男性31例，女性27例?；颊吣挲g34～79歲，中位年齡55.8歲。結(jié)腸癌24例，直腸癌34例。低分化癌35例，中高分化癌23例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移9例。Dukes A期1例，B期7例，C期37例，D期13例。全部患者在手術中均采集癌組織及癌旁正常組織標本（距腫瘤邊緣10cm處）各一塊，立即置于液氮中冷凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫冰箱中保存用于實驗。

1.2 主要試劑

RNA提取及RT-PCR檢測試劑盒購自Promega公司。

1.3 引物的設計及合成

根據(jù)GenBank中登錄的Survivin基因序列（NM_001168）設計一對引物，P1：5'-ATTCGTCCGGTTGCGCTTTCCTTT-3'；P2：5'-TTCCT AAGACATTGCTAAGGGGC C-3'，擴增片段長度297bp。以β-actin為內(nèi)對照，設計引物序列為：P1：5'- GGACCTGAC CGACT ACCTCA-3'；P2：5'- AATCCACATCTGCTGGAAGG-3'，擴增片段長度523 bp。均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.4 總RNA的提取

取冰凍組織50 mg切成薄片，用冷PBS洗滌后，按RNA抽提試劑盒說明抽提總RNA。經(jīng)紫外分光光度計于260nm 和280nm波長下測定吸光度值，并行RNA 甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳以檢測抽提純度及完整性。

1.5 Survivin基因的RT-PCR擴增

取1μg總RNA，以用Oligo（dT）為引物按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明在M-MLV作用下合成cDNA第一鏈。然后以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，按下述程序進行PCR反應：94℃ 5min；95℃ 1min，55 ℃ 1min，72℃ 1min，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.6 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 10.0 統(tǒng)計軟件對結(jié)果進行卡方檢驗，以P＜0.05為差別有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 Survivin基因mRNA在結(jié)直腸癌及癌旁正常組織中的轉(zhuǎn)錄水平

RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，所有標本中均有β-actin的穩(wěn)定表達，說明實驗結(jié)果可靠（圖1）。結(jié)果顯示，58例結(jié)直腸癌標本中Survivin mRNA陽性表達39例，陽性率為67.2%，而癌旁正常組織標本中則無1例表達，兩者差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析

2.2 Survivin 表達與結(jié)直腸癌臨床病理特征的相關性

統(tǒng)計分析表明，結(jié)直腸癌組織中Survivin基因表達與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位及組織學分化程度均無關（P＞0.05），而與Dukes分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關（P＜0.05），見表1。

表1 結(jié)直腸癌組織中Suvivin 表達水平與臨床病理特征的相關

3 討 論

結(jié)直腸癌是我國常見的惡性腫瘤，其發(fā)生和發(fā)展機制尚未完全闡明。目前的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的凋亡抑制可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中有重要的作用[3,4]。Survivin于1997年[5,6]被發(fā)現(xiàn)，是凋亡抑制蛋白（IAP）家族中分子量最小、抗凋亡作用最強的成員。研究報道，Survivin特異表達于人和鼠的胚胎發(fā)育組織以及多數(shù)人類腫瘤細胞，而在正常成人組織的表達僅見于胸腺、睪丸和分泌期子宮內(nèi)膜[7-9]。它可能主要通過兩種方式抑制細胞凋亡[5,10,11]：一是通過其蛋白激酶結(jié)構域特異地結(jié)合caspase-3和caspase-7而直接阻斷細胞凋亡過程；二是競爭結(jié)合p21-Cdk4復合物上的Cdk4，使p21成為游離狀態(tài)，游離的p21與caspase-3結(jié)合后反饋抑制caspase-3的活性，間接阻止細胞凋亡。

目前，Survivin在結(jié)直腸癌組織中的表達還未取得統(tǒng)一認識[12-14]。本研究應用RT-PCR方法檢測了58例結(jié)直腸癌患者癌組織和癌旁正常組織中Survivin基因的表達情況，結(jié)果表明Survivin基因在58例結(jié)直腸癌組織中的陽性表達率為67.2%，而在癌旁正常組織中均不表達。提示Survivin與結(jié)直腸癌的發(fā)生有關，也可能在結(jié)直腸癌的演變過程中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤患者外周血的血清中提取到了Survivin抗體[15,16]，提示它可能作為一個較為普遍的腫瘤標志物用于結(jié)直腸癌及其他惡性腫瘤的早期診斷。但不無爭議，Gianani等[17]報道用免疫組織化學的方法在結(jié)直腸的正常、增生、癌前病變和癌組織中均能檢測到Survivin，只是表達程度不同，認為其不能作為腫瘤標志物。而學者Kawasaki等[18,19]則認為這種在大腸正常組織中不表達，而在腺瘤組織出現(xiàn)表達說明Survivin基因是在大腸癌發(fā)生早期階段（腺瘤階段）被激活并開始表達，可以認為Survivin的過度表達是結(jié)直腸上皮癌變過程的早期事件，其可作為腫瘤標志物。這方面的研究還在繼續(xù)深入，在今后的臨床工作中將著重這方面的研究。

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