李志士,梁海英,于天華

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,吉林長(zhǎng)春 130021;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院輸血科)

DNA微列陣技術(shù)檢測(cè)戊型肝炎病毒方法的建立及初步應(yīng)用

李志士1,梁海英2,于天華2

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,吉林長(zhǎng)春 130021;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院輸血科)

目的建立DNA微列陣技術(shù)檢測(cè)戊型肝炎病毒方法,進(jìn)而探討該方法用于檢測(cè)臨床標(biāo)本的可行性。方法通過生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫戊型肝炎病毒基因進(jìn)行檢索和篩選,應(yīng)用分子生物學(xué)軟件,進(jìn)行序列分析、引物及探針設(shè)計(jì),并進(jìn)行驗(yàn)證,建立了戊型肝炎病毒DNA微列陣技術(shù)檢測(cè)方法。結(jié)果試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的探針僅與HEV的PCR產(chǎn)物雜交呈陽性,與乙肝、丙肝等對(duì)照病毒的PCR產(chǎn)物雜交呈陰性。敏感性試驗(yàn)顯示,該方法比同巢式PCR方法檢測(cè)戊型肝炎病毒敏感度要高,用該方法檢測(cè)了長(zhǎng)春地區(qū)50份疑似HEV臨床病料,38份陽性;而用巢式PCR法擴(kuò)增HEV ORF1基因確診為陽性的只有35份。結(jié)論利用DNA微列陣技術(shù)檢測(cè)戊型肝炎病毒方法,特異性和敏感性強(qiáng),可作為HEV臨床標(biāo)本檢測(cè)方法。

戊型肝炎病毒;核酸探針;檢測(cè)

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0996)

目前戊型肝炎病毒的檢測(cè)方法主要包括兩大 類:一是即就用基因工程重組抗原建立的抗體診斷方法,其診斷手段主要是采用間接ELISA方法檢測(cè)血清中的抗體;另一類是采用RT-PCR為基礎(chǔ)建立的基因診斷方法,其診斷手段主要是利用RT-nPCR檢測(cè)病毒RNA。本文應(yīng)用DNA微列陣技術(shù)檢測(cè)戊型肝炎病毒[1],現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 酶及主要試劑

Taq DNA聚合酶購(gòu)自上海生工;PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自v-gene生物科技有限公司;dNTP購(gòu)自Promega公司;DNA Marker DL 2000、dNTPs購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;鮭魚精DNA購(gòu)自Sigma公司,高純度病毒核酸提取試劑盒(High Pure Viral Nucleic Acid Kit,Roche Molecular Biochemicals產(chǎn)品)。反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、RNA酶均為大連寶生物工程公司及promega等公司產(chǎn)品。

1.2 主要儀器

MicroGrid TAS型芯片點(diǎn)樣儀(BioRobotics公司)、384孔板、Personal 4100A型芯片掃描儀(GenePix公司)、GenePix4.1軟件(GenePix公司)、PCR 擴(kuò)增儀(GeneAmp PCR sydt 2400)等。

1.3 引物的合成

查閱相關(guān)文獻(xiàn),根據(jù)genebank報(bào)道的Ag85A序列(X57230),選擇戊型肝炎病毒ORF2基因一段高度保守的序列,委托上海生物工程公司合成一對(duì)引物,其中引物序列M3:5′-GTC(T)ATGC(T)TGCATACATGGCT-3′(6 010-6 031);M4:5-AGCCGACGAAATC(T)AATTCTGTC-3′(6 336-6 351),引物 5′端進(jìn)行HEX修飾,用來擴(kuò)增ORF2基因一段高度保守的序列。

1.4 探針的設(shè)計(jì)與合成

應(yīng)用Array Designer2.0設(shè)在上述引物序列所擴(kuò)增片段內(nèi)設(shè)計(jì)多條特異性寡核苷酸作為DNA探針,以保證所選探針與其他病毒無同源性。

1.5 HEV基因組的提取及cDNA合成

按照 TRIZOL Reagent使用說明操作。4 μ l用于PCR,剩余-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 DNA微列陣的制備

用MicroGrid TAS型點(diǎn)樣儀通過機(jī)械手臂分別以夾縫針接觸式點(diǎn)樣方式印跡于玻片上,探針的點(diǎn)樣濃度為35 μ M,按圖1陣列進(jìn)行點(diǎn)樣,其中芯片列陣中A號(hào)位點(diǎn)為陽性坐標(biāo)探針,其序列為:5′-NH2-ggtcactcgttacgaacgc-cy3-3′,5′端使用 cy3進(jìn)行熒光修飾,1/2/3/4/5/6為相對(duì)應(yīng)的特異性寡核苷酸探針,0號(hào)為空白對(duì)照,芯片點(diǎn)樣完畢后,將點(diǎn)樣后的玻片陣列面朝下,放在盛有37℃水的濕盒中,放置12小時(shí)以上固定,進(jìn)行水合及洗滌處理,完成基因芯片的制備。

1.7 樣品處理和雜交

使用上述帶有熒光標(biāo)記的引物對(duì)提取好的cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng),制備探針。將雜交混合液加于芯片列陣上42℃雜交1 h。以上操作均在暗室中進(jìn)行。芯片洗滌后以基因芯片掃描儀掃描分析,出現(xiàn)明顯可見的雜交信號(hào)(斑點(diǎn))判為陽性。

1.8 基因芯片的驗(yàn)證

依照上述樣品處理和雜交方法,對(duì)HEV病毒、乙型肝炎病毒及丙型肝炎病毒陽性樣品PCR反應(yīng),產(chǎn)物檢測(cè)標(biāo)記探針同制備的芯片進(jìn)行雜交分析。雜交程序以上述規(guī)范方法進(jìn)行,掃描分析后以BMP格式圖像判定檢測(cè)結(jié)果。

圖1 探針在芯片上的點(diǎn)樣位置

1.9 臨床樣品的檢測(cè)及同巢式PCR的比較 分別使用本試驗(yàn)方法和巢式PCR方法對(duì)長(zhǎng)春地區(qū)50份疑似HEV臨床病料進(jìn)行檢測(cè)并進(jìn)行靈敏度比較,其中巢式PCR所使用引物為以M1、M2為外引物:M3、M4為內(nèi)引物;M1:5′-AAC(T)TATGCA(C)CAGTACCGGGTTG-3′(5 725-5 746);M2:5′-CCCTTATCCTGCTGAGCATTCTC-3′(6 433-6 455);M3:5′-GTC(T)ATGC(T)TGCATACATGGCT-3′(6 010-6 031);M4:5-AGCCGACGAAATC(T)AATTCTGTC-3′(6 336-6 351)。

2 結(jié)果

2.1 特異性寡核苷酸探針設(shè)計(jì)結(jié)果

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),選擇戊型肝炎病毒ORF2基因一段高度保守的序列,在此段序列內(nèi)根據(jù)芯片探針設(shè)計(jì)原則,設(shè)計(jì)了6條內(nèi)設(shè)計(jì)了特異性寡核苷酸探針,其中探針5′端用NH2修飾并使用T(15)作為NH2與探針之間的連接臂,探針序列見表1。

2.2 基因芯片的制備結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)將經(jīng)NH2修飾的寡核苷酸探針打印到醛基基片,應(yīng)用陽性坐標(biāo)探針對(duì)整個(gè)芯片制備過程進(jìn)行監(jiān)測(cè),芯片點(diǎn)樣后,37℃水的濕盒中,放置12小時(shí)以上固定,經(jīng)過一系列洗滌,探針牢固的固定在醛基基片,芯片點(diǎn)樣后陽性坐標(biāo)探針掃描結(jié)果如圖1所示。試驗(yàn)設(shè)計(jì)基因芯片為4×8陣列,其中陣列第一排與第一列為陽性坐標(biāo)探針,第二、三、四、五、六、七排為HEV檢測(cè)探針,第八排為陰性對(duì)照(圖2)。

表1 實(shí)驗(yàn)中使用的探針

2.3 陽性樣品處理和雜交

使用帶有熒光標(biāo)記的引物對(duì)已知陽性戊型肝炎病毒 cDNA及乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒進(jìn)行PCR擴(kuò)增,之后與芯片進(jìn)行雜交,結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)探針同已知陽性戊型肝炎病毒進(jìn)行PCR產(chǎn)物可特異性雜交,信號(hào)呈陽性,而同乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交沒有信號(hào),表明制備的芯片可檢測(cè)出戊型肝炎病毒ORF2基因片段(見圖3)。

圖2 基因芯片的制備結(jié)果

圖3 陽性樣品檢測(cè)結(jié)果

2.4 臨床樣品的檢測(cè)

檢測(cè)了長(zhǎng)春地區(qū)50份疑似HEV臨床病料,38份陽性;而用巢式PCR法擴(kuò)增HEV ORF1基因確診為陽性的只有35份,其中巢式PCR法所檢測(cè)的35份陽性病料同DNA微陣列法檢測(cè)的結(jié)果為交集,結(jié)果完全符合。

3 討論

本試驗(yàn)進(jìn)行了DNA微列陣技術(shù)檢測(cè)戊型肝炎病毒方法的研究,應(yīng)用生物信息學(xué)方法針對(duì)戊型肝炎病毒ORF2基因保守片段設(shè)計(jì)了特異性寡核苷酸探針,并進(jìn)行點(diǎn)樣雜交,成功制備了HEV核酸診斷用DNA微列陣,并進(jìn)行了制備DNA微列陣的檢驗(yàn)研究;建立了DNA微列陣診斷HEV核酸的檢測(cè)技術(shù)。該檢測(cè)技術(shù)可以靈敏特異地對(duì)HEV病毒進(jìn)行檢測(cè),具有檢測(cè)靈敏性好、特異性高和芯片可重復(fù)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。

近年來,隨著基因芯片技術(shù)的發(fā)展,在疫病檢測(cè)中得到了越來越多的應(yīng)用[2-4]。常規(guī)的基因診斷技術(shù)主要包括核酸分子雜交、聚合酶鏈反應(yīng)、限制性酶切圖譜分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析以及DNA序列測(cè)定等技術(shù),這些技術(shù)己廣泛應(yīng)用于人畜傳染病的檢測(cè)和診斷,如PCR技術(shù)作為當(dāng)前基因診斷中最主要的技術(shù),常與其他技術(shù)性聯(lián)合,在傳染性疾病的分子診斷中得到了廣泛的應(yīng)用,但由于PCR試驗(yàn)常出現(xiàn)假陽性、假陰性結(jié)果,嚴(yán)重干擾了疾病的診斷和治療。因此高特異性自動(dòng)化仍是分子生物學(xué)診斷方法需要解決問題。芯片技術(shù)可用大量核酸探針同時(shí)檢測(cè)混合核酸,得出大量相關(guān)數(shù)據(jù),通過對(duì)這些數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)化處理便獲得了相關(guān)病原體的基因信息,從而對(duì)病原體進(jìn)行分型、亞型,以及致病性強(qiáng)弱、變異進(jìn)行確切的判斷,結(jié)果客觀、靈敏性高,特異性高。實(shí)驗(yàn)證明,這一思路是可行的,由于DNA芯片技術(shù)則具備可以對(duì)成百上千、甚至上萬個(gè)基因進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì),在此基礎(chǔ)之上可以在芯片平臺(tái)上不斷增加探針,進(jìn)而可以將甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒及丙型肝炎等病毒的特異性探針集成在一張芯片上,建立高通量的肝炎病毒檢測(cè)方法。使臨床肝炎病毒的檢測(cè)變得更加方便。

[1]Schena M S D,Davis RW,BrownPO.Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray[J].Science,1995,270:467.

[2]Richmond CS G J,Mau R,Jin H,Blattner FR.Genome-wide expression profiling inEscherichia coliK-12[J].Nucleic Acids Res,1999,27:3821.

[3]Ang S,Lee C Z,Peck K,et al.Acid-induced gene expression in Helicobacter pylori:shady in genomic scale by microarray[J].Infect Immun,2001,69(3):1679.

[4]Striebel HM B-H E,Egerer R.Virus diagnostics on microarray[J].Current Pharmaceutical Biotechnology,2003,4:401.

DNA microarray detection of hepatitis E virus Establishment and preliminaryapplication of methods

LI Zhi-shi,LIANGHaiying,YU Tian-hua.(The Affiliated Hospital of ChangchunUniversity of Traditional Chinese Medicine,Changchun130021,China)

ObjectiveTo establish a hepatitisE virus nucleic acidprobe detectionmethods,and thenexplore the method used to detect the feasibility of clinical samples.MethodsBiomedical hepatitis E virus genome database retrieval and filtering,the application of molecular biology software for sequence analysis,primer and probe design and carry outverification,establishment of hepatitis E virus nucleic acid probe detection methods.ResultsThe results of tests designed to probe the PCR product only with HEV positive hybridization with hepatitis B,hepatitis C virus,such as the control PCR product of hybridizationwere negative.Sensitivity tests have shown that this method is comparedwith the nested-PCR detection of hepatitis E virus,And Using thismethod to detect 50 copies in Changchun area of clinical disease suspected HEV material,38were positive;while nested-PCR amplification of HEV ORF1 gene diagnosed as positive,only 35 copies.ConclusionThe use of hepatitis E virus nucleic acid probe detection methods,specificity and sensitivity of strong clinical samples can be used asHEV detection methods.

hepatitis E virus;DNA probe;Detection

R512.6

A

1007-4287(2010)07-0996-03

2009-04-07)