崔煥波,艾金霞

(1.吉林省公安邊防總隊(duì)醫(yī)院,吉林長春 130051;2.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院 免疫教研室)

SBHL對(duì)甲狀腺鱗癌細(xì)胞株SW579生長抑制作用的研究

崔煥波1,艾金霞2

(1.吉林省公安邊防總隊(duì)醫(yī)院,吉林長春 130051;2.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院 免疫教研室)

目的觀察SBHL對(duì)甲狀腺鱗癌SW579細(xì)胞生長的抑制作用,從分子水平探討SBHL對(duì)甲狀腺鱗癌SW579細(xì)胞生長抑制作用的機(jī)制。方法用MTT比色法觀察不同濃度和作用時(shí)間的SBHL對(duì)甲狀腺鱗癌SW579細(xì)胞增殖的影響;用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行分析;TRAP-銀染法檢測端粒酶活性。結(jié)果5×10-5mol/L-1×10-3mol/LSBHL對(duì)甲狀腺鱗癌SW579細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用,這種抑制作用隨SBHL濃度的增加而增加;流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行分析的結(jié)果顯示,隨著SBHL濃度的增加,S期細(xì)胞含量逐漸降低,G1期細(xì)胞含量逐漸增加,SBHL將細(xì)胞阻滯于G1期,抑制DNA合成。SBHL處理的甲狀腺鱗癌SW579細(xì)胞與對(duì)照組相比,端粒酶活性明顯降低。結(jié)論(1)SBHL對(duì)甲狀腺鱗癌SW579細(xì)胞生長具有明顯的抑制作用,而且這種抑制作用與SBHL的濃度呈正相關(guān)。(2)其機(jī)制可能與下調(diào)端粒酶活性,進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞生長有關(guān)。

澳洲茄胺鹽酸鹽(SBHL);甲狀腺鱗癌;端粒酶

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0982)

SBHL(帶碼)即澳洲茄胺鹽酸鹽為中藥一類新藥,分子量為450.10,樣品純度大于99.2%。SBHL是從龍葵濃縮果汁中提取出的一種單體成分。國內(nèi)外有對(duì)龍葵的成分、分離方法、抗凝血作用、抗腫瘤及對(duì)血糖作用的研究[1]。目前研究表明,SBHL對(duì)人體肝癌、肺癌、胃癌、宮頸癌、HeLa細(xì)胞均有明顯的抑制作用;實(shí)驗(yàn)表明澳洲茄胺鹽酸鹽通過增強(qiáng)免疫力,抑制核糖核酸的合成、代謝,誘導(dǎo)細(xì)胞分化作用[2,3]。SBHL能顯著下調(diào)HeLa細(xì)胞 c-myc基因、對(duì)正常細(xì)胞生長影響較小[4]。但其對(duì)甲狀腺鱗癌SW579細(xì)胞生長抑制作用及抗腫瘤作用機(jī)制尚未見研究報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料 甲狀腺鱗癌SW579細(xì)胞購自吉林省腫瘤研究所;RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO公司);新生胎牛血清(北京鼎國生物公司);MTT(華美公司Sigma分裝);DMSO(Sigma公司);CO2孵箱(日本平澤制作所);流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter Epics XL);酶標(biāo)儀(南京華標(biāo)儀器廠);SBHL由北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院劉良教授提供 。

1.2 方法

1.2.1 MTT比色試驗(yàn) 將甲狀腺鱗癌細(xì)胞株SW579單細(xì)胞濃度調(diào)整到1×105/ml,接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔 200 μ l;37℃,5%CO2。甲狀腺鱗癌細(xì)胞株SW579分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的SBHL,使其終濃度分別為1×10-5mol/L、5×10-5mol/L、1×10-4mol/L、5×10-4mol/L、1×10-3mol/L,各組細(xì)胞均在培養(yǎng)24 h后加藥,陰性對(duì)照組加入培養(yǎng)液;陽性對(duì)照組加入25 μ g/ml的 5-FU培養(yǎng)液;空白組為不加細(xì)胞培養(yǎng)液作本底對(duì)照調(diào)零,各設(shè)復(fù)孔3個(gè) ;培養(yǎng)細(xì)胞 24、48、72、96小時(shí)分別取一塊板,吸棄培養(yǎng)液,加入 5 mg/ml的MTT,20 μ l/孔。繼續(xù)孵育4 hrs后,吸出各孔上清,加入二甲亞砜(DMSO),150 μ l/孔;用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定各孔吸光度值(A值)并計(jì)算抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值)×100%

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù) 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔1 ml。實(shí)驗(yàn)組分別加入含有不同濃度藥物(1×10-5mol/L、5×10-5mol/L、1×10-4mol/L、5×10-4mol/L、1 ×10-3mol/L)每孔 50 μ l;對(duì)照組加入生理鹽水;各設(shè)復(fù)孔3個(gè);藥物作用后72 hrs后,各孔細(xì)胞用0.25%的胰酶消化,收集在離心管離心(1 000 rpm/min)5min。PBS液漂洗2次。加入70%的冷乙醇固定,4℃冰箱保存過夜;棄乙醇,以PBS液漂洗;100目篩網(wǎng)過濾;離心后加入PI工作液0.5 mL,室溫避光30 min,上機(jī)檢測;使用Cell FIT軟件分析結(jié)果。

1.2.3 TRAP-銀染法檢測端粒酶活性 培養(yǎng)細(xì)胞及加藥處理同形態(tài)學(xué)觀察。分別在48、72小時(shí)后用適量胰酶消化離心收集細(xì)胞。每組收集細(xì)胞5×106個(gè)細(xì)胞用于PCR實(shí)驗(yàn);取 15 μ l PCR產(chǎn)物,與適量上樣緩沖液充分混合后,加入上樣孔中;接好電極,電壓為80 V,電泳2 h左右,根據(jù)指示劑遷移位置來判定是否終止電泳;PAGE膠銀染后用雙蒸水清洗幾分鐘,照像。

2 結(jié)果

2.1 MTT比色試驗(yàn) 用MTT比色法測定不同濃度SBHL對(duì)SW579細(xì)胞增殖的影響見表1。

2.2 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果 見表2、3。

2.3 端粒酶活性檢測結(jié)果 端粒酶活性檢測結(jié)果(圖1)可以清楚的看到,對(duì)照組的電泳結(jié)果中可以比較清楚的看到15-16條條帶,故可判斷端粒酶活性為陽性,經(jīng)RNA酶處理過的陰性對(duì)照組沒有可見條帶。從各藥物處理組的 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果可以看到,1×10-5mol/L組能夠觀察到8-9條亮度較低的條帶外,1×10-4mol/L組所看到的條帶很少且顏色淺。1×10-3mol/L組幾乎都不能觀察到條帶。

表1 SBHL對(duì)SW579細(xì)胞增殖抑制率的影響

表2 不同濃度的藥物處理對(duì)SW579細(xì)胞周期的影響(±s n=3)

表2 不同濃度的藥物處理對(duì)SW579細(xì)胞周期的影響(±s n=3)

與對(duì)照組(藥物濃度0 mol/L)相比:＊P＜0.05▼P＜0.01

藥物濃度(mol/L)細(xì)胞周期G1 S G2 0 56.7±2.57 21.2±3.63 22.1±3.06 1×10-5 60.2±1.58▼ 20.9±3.62 21.7±2.49 5×10-5 64.2±1.32▼ 20.2±3.30 20.5±2.51 1×10-4 64.6±2.32▼ 16.7±3.67▼ 19.9±2.11 5×10-4 66.7±2.48▼ 14.7±3.32▼ 19.6±2.03 1×10-3 78.1±2.91▼ 10.5±2.84▼ 11.5±3.01▼

表3 不同濃度的藥物處理對(duì)SW579細(xì)胞凋亡率的影響(±s n=3)

表3 不同濃度的藥物處理對(duì)SW579細(xì)胞凋亡率的影響(±s n=3)

與對(duì)照組(藥物濃度0 mol/L)相比:＊P＜0.05▼P＜0.01

藥物濃度(mol/L) 凋亡率(%)0 1.9±1.3 1×10-5 5.4±2.42▼5×10-5 6.8±2.65▼1×10-4 21.8±2.53▼5×10-4 24.7±1.45▼1×10-3 28.9±1.90▼

圖1 不同濃度藥物對(duì)SW579細(xì)胞端粒酶活性的影響(±s,n=3)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)不同濃度SBHL與人甲狀腺鱗癌SW579細(xì)胞共同孵育24 h、48 h、72 h、96 h四個(gè)時(shí)間段后測其A值并計(jì)算細(xì)胞生長抑制率,結(jié)果在1×10-5mol/L-1×10-3mol/L的濃度范圍內(nèi)細(xì)胞增殖受到不同程度抑制,細(xì)胞生長抑制率與藥物濃度和藥物作用時(shí)間呈依賴關(guān)系。

從周期變化來看,SBHL作用72小時(shí)后可使甲狀腺鱗癌SW579細(xì)胞受阻于GI期,導(dǎo)致 S期細(xì)胞降低。因?yàn)槟[瘤細(xì)胞增殖的快慢,主要取決于細(xì)胞G0/GI期的長短,G0/GI期短,腫瘤細(xì)胞增殖快,處于G0/GI期的細(xì)胞數(shù)少,故GI期阻滯可使細(xì)胞生長周期延長,細(xì)胞的惡性增殖減慢,同樣說明了SBHL對(duì)甲狀腺鱗癌SW579細(xì)胞的抑制作用。

應(yīng)用流式細(xì)胞儀PI染色法對(duì)SBHL作用72小時(shí)后的甲狀腺鱗癌SW579細(xì)胞DNA含量進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示,SW579細(xì)胞經(jīng)1×10-5mol/L-1×10-3mol/L濃度的SBHL作用后都發(fā)現(xiàn)了位于G I期前的亞G I鋒,且凋亡率呈濃度依賴性。

本實(shí)驗(yàn)從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,可明顯的看到對(duì)照組的電泳條帶多,且清晰,隨著藥物濃度的升高,條帶也越來越少且不清晰,當(dāng)藥物濃度為1×10-3mol/L時(shí),已幾乎看不到條帶。提示隨著藥物作用濃度的增加,端粒酶的活性有明顯的降低,說明甲狀腺鱗癌細(xì)胞的惡性程度減低,SBHL具有抗腫瘤作用。

[1]謝啟梅,謝軍榮.龍葵在腫瘤治療中的應(yīng)用[J].江西中醫(yī)藥,1996,27(2):52.

[2]艾金霞,劉 良.SBHL對(duì)HeLa細(xì)胞生長抑制作用的影響[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,25:1791.

[3]艾金霞,劉 良.SBHL對(duì)小鼠免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國免疫學(xué)雜志,2007,8:1791.

[4]艾金霞,劉 良.SBHL對(duì)人宮頸癌細(xì)胞凋亡作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].北華大學(xué)學(xué)報(bào),2008,1:221.

Study of the inhibition of SBHL on growth of thyroid gland cancer SW579 cells

CUI Huan-bo,AI Jin-xia.(Jilin Province Public Security BorderDefense Corps Hospital,Laboratory Medicine,Changchun130051,China)

ObjectiveTo observe the inhibiting effects of Sdosodine Hydrochlorida on the growth of thyroid gland cancer SW579 cells and investigate the inhibiting mechanisms from molecular levels.MethodsThe proliferation of thyroidgland cancer SW579 cells were observed by MTT assay.The changes of the cell cycle of Hela cell treated with Sdosodine Hydrochlorida were analyzed by FlowCytometry.The tolermerase activity were detected by TRAP-silver staining.ResultsThe proliferation of thyroid gland cancer SW579 cells were inhibited at 1×10-5mol/L-1×10-3mol/L Sdosodine Hydrochlorida.The inhibiting effect increased gradually following the increase of concentration of Sdosodine Hydrochlorida.The percentage of thyroid gland cancer SW579 cells in S phase decreased and the percentage of cells in G1 phase increased after treated by Sdosodine Hydrochloridia,indicating Sdosodine Hydrochlorida arrested thyroid gland cancer SW579 cells in G1 phase and thus the systhesis of DNA was inhibited.After treated by Sdosodine Hydrochlorida,the expressions of telomerase of thyroid gland cancer SW579 cells were downregulated obviously.Conclusion(1)The growth of thyroid gland cancer SW579 cells were inhibited obviously by Sdosodine Hydrochlorida and the inhibiting effect was dependent on concentration of Sdosodine Hydrochlorida;(2)The tolermerase activity were downregulated,the growth of thyroid gland cancer SW579 cells were inhibited by Sdosodine Hydrochlorida.

Sdosodine Hydrochloridia;thyroid gland cancer SW579 cells,telomerase

R733.705

A

1007-4287(2010)07-0982-03

吉林市卓怡康納中藥研發(fā)基金(ZY040301)

*通訊作者

2009-03-09)