于 音,趙興利*,田 宇,邵佳甲,郭永川,付 堯,梁前壘,李衍鑫

(1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院神經外二科,吉林 長春 130033;2.長春職業(yè)技術學院)

大鼠骨髓間充質干細胞向神經元樣細胞定向誘導分化及免疫組化鑒定

于 音1,趙興利1*,田 宇1,邵佳甲2,郭永川1,付 堯1,梁前壘1,李衍鑫1

(1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院神經外二科,吉林 長春 130033;2.長春職業(yè)技術學院)

目的建立體外分離、培養(yǎng)大鼠骨髓間充質干細胞(MSCs)的方法,體外誘導其向神經元樣細胞方向分化。方法應用細胞培養(yǎng)技術從大鼠股骨、脛骨中分離、純化骨髓間充質干細胞并在體外進行培養(yǎng),以形態(tài)學方法鑒定間充質干細胞,在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)特征,利用含10 ng/ml bFGF的LG-DMEM及含200μ mol/L BHA、2%DMSO的無血清DMEM誘導其向神經元樣細胞分化,并通過免疫組化方法鑒定。結果經原代及傳代培養(yǎng)的骨髓間充質干細胞呈梭形,類似于成纖維細胞;成神經元誘導24 h后,多數(shù)MSCs變?yōu)榈湫偷纳窠浽獦蛹毎?胞體向胞核收縮并有較多的長突起,免疫組化顯示神經元特異性標志NSE、神經巢蛋白Nestin染色陽性。結論體外成功的進行了MSCs原代及傳代培養(yǎng),細胞生長穩(wěn)定、增殖迅速并可多次傳代,經誘導后具有向神經元樣細胞分化潛能。

骨髓;間充質干細胞;誘導;大鼠;分化

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0991)

骨髓間充質干細胞是存在于骨髓組織中多種干細胞的混和體,因其具有取材方便、擴增迅速、可自體移植并且具有多分化潛能等特點[1,2]近年來越來越受到關注。MSCs與神經組織修復、骨、軟骨組織修復、肌組織、肌腱組織修復以及皮膚創(chuàng)面愈合等都有很密切的關系。

本實驗從大鼠骨髓中取出骨髓基質細胞后進行體外原代及傳代培養(yǎng),經過多次傳代以獲得較純的MSCs,從形態(tài)學上觀察和鑒定MSCs,誘導其向神經元樣細胞方向分化,證實其具有神經元樣分化潛能。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 120-180 g Wistar大鼠20只;低糖DMEM培養(yǎng)基,胎牛血清FBS,0.25%胰蛋白酶,Percoll分離液,bFGF,BHA,DMSO。

1.2 實驗方法

1.2.1 骨髓間充質干細胞的培養(yǎng) 取Wistar大鼠,3%戊巴比妥鈉按10mg/kg體質量的劑量行腹腔注射麻醉。無菌條件下,暴露左右兩側股骨及脛骨表面,用一只固定有18號針頭內含0.1 mL肝素(3 000 U/mL)的5 mL注射器從骨髓中抽取2 mL骨髓液,抽吸物用PBS溶液沖洗3次后,用DMEM培養(yǎng)基懸浮,將單細胞懸液緩慢加在1.073 g/cm3的Percoll分離液上部,350 g離心30 min,然后小心吸取位于分離液中間的乳白色細胞層,DMEM重懸后180 g離心5 min,以3×106密度接種于培養(yǎng)瓶中。將細胞置于37℃、體積分數(shù)為5%CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱內培養(yǎng),接種后72 h首次換液,置換以新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,每3 d換液,第7天首次傳代,將已經70%-80%長滿的細胞用0.25%胰蛋白酶消化,再用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸,以1∶2比例接種于新培養(yǎng)瓶中,以后每3 d換液,待細胞70%-80%長滿時再次傳代。

1.2.2 倒置顯微鏡觀察 40及100倍倒差顯微鏡下逐日觀察細胞的生長情況及形態(tài)特征。

1.2.3 MSCs向神經元樣細胞定向誘導分化及免疫組化鑒定

1.2.3.1 定向誘導分化 取第3代細胞,接種于24孔培養(yǎng)板,每孔約1×105個細胞,分對照組及誘導組,對照組不加入誘導劑,待細胞80%融合時,誘導組加入含10 ng/ml bFGF的LG-DMEM(10%FBS)預誘導24 h,更換培養(yǎng)液,PBS洗滌3次,再加入含200 μ mol/L BHA、2%DMSO的無血清DMEM 誘導,每3 d換液,共培養(yǎng)6 d;

1.2.3.2 免疫組化鑒定 誘導細胞用4%多聚甲醛固定30 min,PBS洗滌5次,每次3 min,3%過氧化氫室溫孵育10 min,以消除內源性過氧化物酶,之后用正常山羊血清封閉,室溫10 min,分別加入兔抗大鼠NSE 多抗(1∶100稀釋)、Nestin多抗(1∶100稀釋)、GFAP多抗(1∶100稀釋),濕盒4℃過夜后洗滌,生物素標記二抗37℃孵育30 min,鏈霉親合素-過氧化物酶溶液37℃孵育30 min,DAB顯色,蘇木素復染,梯度酒精脫水(75%,85%,95%,100%),二甲苯透明,中性樹膠封片,鏡下觀察計算陽性細胞數(shù),隨機數(shù)取10個非重疊視野(×100),計算NSE和Nestin陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例,以PBS代替一抗做陰性對照。

2 實驗結果

2.1 骨髓間充質干細胞原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng) 細胞約24 h貼壁,48 h后貼壁細胞明顯增多,并開始分裂增殖,圓形細胞變形伸出偽足,約7 d可70%-80%長滿培養(yǎng)瓶壁,此時細胞逐漸融合成單層,形態(tài)變?yōu)閳A形、多角形、梭形或不規(guī)則形,呈集落狀生長,并出現(xiàn)核分裂相,細胞常圍繞集落中央呈島狀分布,可重疊生長,并分泌大量基質。傳代后細胞約24h貼壁,逐漸伸展為梭形、紡錘形、多角形,胞體較原代略膨大,3-5 d即可長滿培養(yǎng)瓶壁。連續(xù)傳代后,細胞逐漸變?yōu)樾螒B(tài)更均一、排列更有序的成纖維細胞樣。

2.2 神經元樣細胞定向誘導分化及免疫組化鑒定

2.2.1 誘導后細胞形態(tài)觀察 預誘導24 h后,原來梭形的MSCs胞體發(fā)生收縮,體積變小,立體感增強,細胞邊緣變得不規(guī)整,并出現(xiàn)許多細的突起,胞體類似于錐形或球形(見圖1)。誘導2 h后,少數(shù)MSCs開始出現(xiàn)明顯的形態(tài)變化,胞質向胞核收縮,呈典型的核質體形態(tài),胞體逐漸變成圓形或錐形,且折光性增強,胞體周圍具有較強的光暈,突起繼續(xù)延長(見圖2);在誘導后5-24 h中,MSCs逐漸開始向神經元樣細胞轉化,數(shù)量隨時間不斷增多,形成雙極或多極細胞,類似于樹突結構(見圖3);24 h后,多數(shù)MSCs變?yōu)榈湫偷纳窠浽獦蛹毎?其胞體向胞核收縮成錐形且變得致密而有折光性,有較多的長突起,有些長突起末端形成長錐樣的膨大及絲狀偽足。多個神經元樣細胞的突起可相互延伸并形成網狀(見圖4)。

2.2.2 免疫組化鑒定 為了進一步證實誘導分化出來的神經元樣細胞,分別進行了神經元特異性標志NSE、神經巢蛋白Nestin和星形膠質細胞特異性標志GFAP的免疫組化染色分析,發(fā)現(xiàn)神經元樣細胞的胞體及部分突起NSE和Nestin染色呈陽性(DAB顯色棕色者為陽性細胞),GFAP染色為陰性,對照組染色均為陰性。從而進一步說明誘導分化所得的細胞為神經元,而不是星形膠質細胞。

2.2.3 神經樣細胞的定量分析 經過定量計數(shù)分析發(fā)現(xiàn)用上述方法定向誘導MSCs后出現(xiàn)NSE陽性的細胞約為(79.5±3.2)%,Nestin陽性的細胞約為(73.8±2.6)%。說明用上述定向誘導分化方法可獲得比例較高的神經元樣細胞。

圖1 預誘導24 h:胞體收縮,邊緣不規(guī)整,類似于球形(100×)

圖2 誘導2 h:胞體變成圓形或錐形,折光性增強,突起延長(100×)

圖3 誘導5 h:細胞形成雙極或多極結構,類似于樹突結構(100×)

圖4 誘導24 h:典型的神經元樣結構,有較多的長突起,突起末端形成長錐樣的膨大及絲狀偽足,相互延伸形成網狀(100×)

3 討論

德國病理學家Cohnheim首先提出在骨髓基質中存在有向非造血系統(tǒng)多向分化的干細胞[3]。1968年Friedenstein等首先證實骨髓間充質干細胞在骨髓組織中的存在。近年來,MSCs的多向分化潛能[4,5]越來越受到研究者的關注,因其具有取材方便安全、來源豐富、損傷小,易于體外培養(yǎng)擴增,在體外可長時間保持未分化狀態(tài),體外基因轉染率高,并能穩(wěn)定高效表達多種治療性外源基因,而且自體獲取的MSCs回植后不會發(fā)生免疫排斥反應等優(yōu)點[6,7],骨髓間充質干細胞已經成為重要的組織工程種子細胞,因此隨著組織細胞工程學和基因工程學的興起,骨髓間充質干細胞必將為神經組織修復、骨缺損、創(chuàng)傷愈合等的治療開辟廣闊前景[8]。

體外獲得的MSCs為各種細胞的混合體,至今尚未形成一套理想的分離純化MSCs的方法。目前用于分離MSCs常用的方法主要有3種[9,10],即貼壁篩選法、流式細胞儀分離法和密度梯度離心法。本實驗采用了密度梯度離心法與貼壁培養(yǎng)法相結合的方法,在取出兔的骨髓細胞后,用比重為1.073的Percoll密度梯度分離液分離骨髓細胞,經梯度離心后,由于比重差別能有效地將絕大部分紅細胞、粒細胞、脂肪細胞和血小板除去,獲得純度較高的單個核細胞,然后根據(jù)MSCs與血細胞貼壁性能差異,經體外貼壁培養(yǎng),隨換液棄除懸浮生長的血細胞。原代培養(yǎng)貼壁的細胞主要是MSCs,也可能混有單核細胞、淋巴細胞,利用它們在培養(yǎng)瓶壁的貼壁性不同,每次傳代用0.25%胰蛋白酶消化3-5分鐘,MSCs迅速從培養(yǎng)瓶上脫落,而淋巴細胞、單核細胞由于貼附性強仍附于培養(yǎng)瓶壁,嚴格掌握消化酶的量和消化時間,保證MSCs在短的作用時間內與培養(yǎng)瓶壁分開,從而使MSCs得到進一步純化[11]。

原代培養(yǎng)骨髓間充質干細胞約24-48小時貼壁,細胞初為淋巴細胞樣小圓細胞,24-48小時后貼壁細胞明顯增多,并開始分裂增殖,圓形細胞變形伸出偽足。約8-10天可鋪滿培養(yǎng)瓶壁,細胞逐漸融合成單層。此時細胞為圓形、多角形、梭形或不規(guī)則形,呈集落狀生長,并出現(xiàn)核分裂相。不傳代細胞,可以持續(xù)生長,細胞常圍繞集落中央呈島狀分布,呈多角形并可重疊生長,并分泌大量基質。傳代培養(yǎng)細胞接種后24小時貼壁,逐漸伸展為梭形、紡錘形、多角形,胞體較原代略膨大,3-5天即可長滿。連續(xù)傳代后,隨著傳代次數(shù)增多,細胞變?yōu)樾螒B(tài)更均一、排列更有序的成纖維細胞樣。向神經元方向誘導中,bFGF作為預誘導劑可能參與骨髓間充質干細胞向神經干細胞分化的啟動,纖維生長因子家族成員在胚胎干細胞分化為神經干細胞中起重要作用,而且bFGF對神經干細胞的增殖也有作用。正式誘導時加入的BHA、DMSO均為強抗氧化劑,其對骨髓MCSs定向誘導作用與其能將細胞從氧化狀態(tài)中釋放出來有關[12]。成神經元誘導24小時后,多數(shù)MSCs變?yōu)榈湫偷纳窠浽獦蛹毎?其胞體向胞核收縮成錐形且變得致密而有折光性,有較多的長突起,有些長突起末端形成長錐樣的膨大及絲狀偽足。免疫組化鑒定顯示神經元特異性標志NSE、神經巢蛋白Nestin染色陽性。說明MSCs具有體外向神經元樣細胞的分化潛能,為今后開展神經干細胞移植修復受損神經組織奠定了基礎。

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neuron cell formation of mesenchymal stem cells of rats by induction differentiation and immunohistochemistry identification

YU Yin,ZHAOXing-li,TIAN Yu,et al.(Department of Neurosurgery,China-Japan Union Hospital of Jilin University,Changchun130033,China)

ObjectiveTo establish method of isolation and culture of rat bone marrow mesenchymal stem cells in vitro and to induce it differentiate to neuro cell.MethodsMSCswere isolated from the femurs and tibias bones and purified and cultured in vitro,MSCs',quality was evaluated with morphology.States ofMSCsgrowing in culture were observedwith invertedmicroscope.MSCs were induced to neuro cell by LG-DMEM including 10 ng/ml bFGF and DMEM including 200μ mol/L BHA 、2%DMSO.They are identified by immunohistochemistry.ResultsThe morphous of MCSswas fusiform shape and fibroblast cell-shape after cultivation of primary and subcultured.Typical neuron cell appear after 24 hours nerve cell induction,NSE and Nestin are expressed positively by immunohistochemistry staining.ConclusionThe method of isolation and culture of rat bone marrow mesenchymal stem cells in vitro is ideal and MCSs have the potency of neuron cell differentiation.

Bone marrow;Mesenchymal stem cells;Induction;Rat;Differentiation

R329.2+8

A

1007-4287(2010)07-0991-03

吉林省科委資助課題(20030536-2)

*通訊作者

2009-03-12)