張冬梅,楊媚婷,劉 瑛,于春雷,烏 垠,李玉新,,鮑永利*

(1.東北師范大學(xué)藥物基因和蛋白篩選國家工程實驗室,吉林長春 130024;2.東北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院;3.白城市中心醫(yī)院)

IKKβ真核表達載體的構(gòu)建及表達

張冬梅1,楊媚婷2,劉 瑛3,于春雷1,烏 垠1,李玉新1,2,鮑永利1*

(1.東北師范大學(xué)藥物基因和蛋白篩選國家工程實驗室,吉林長春 130024;2.東北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院;3.白城市中心醫(yī)院)

目的構(gòu)建核轉(zhuǎn)錄因子κ B抑制蛋白激酶(inhibitor of kappa B kinase,IKK)β真核表達載體,以便進一步探討其生物學(xué)作用。方法從人正常肝細(xì)胞L02中提取RNA,并利用IKKβ特異性引物通過RT-PCR方法擴增了IKKβ cDNA,并克隆入pcDNA3載體中,構(gòu)建重組載體pcDNA3-IKKβ。將重組載體轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞中,并通過免疫印跡方法檢測IKKβ的表達。結(jié)果酶切及測序結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒構(gòu)建成功;免疫印跡結(jié)果顯示,瞬時轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的人胚腎細(xì)胞HEK293中可有效表達IKK β。結(jié)論本研究成功構(gòu)建了IKK β真核表達載體,并能夠在真核細(xì)胞中進行表達,為進一步研究IKKβ的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

IKK β;載體構(gòu)建;真核表達

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0977)

近年來的研究表明,核轉(zhuǎn)錄因子κ B(nuclear factor-kappa B,NF-κ B)通過調(diào)控多種基因的表達,參與細(xì)胞生長、發(fā)育、凋亡等多種生理功能,并在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、纖維化等方面起重要作用[1]。NF-κ B抑制蛋白激酶(inhibitor of kappa B kinase,IKK)β 是NF-κ B激活通路中的關(guān)鍵激酶。外部刺激因子如TNF-α、IL-1、LPS、雙鏈 RNA 和病毒通過激活 IKK[2],誘發(fā)Iκ B 的磷酸化而降 解失活 。NF-κ B 失去 Iκ B 抑 制而活化,從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi),與靶基因κ B位點結(jié)合,迅速誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄[3,4],包括負(fù)反饋機制的自身抑制蛋白 Iκ Bα和 Iκ Bβ、各種細(xì)胞因子和趨化因子、抗凋亡基因、c-myc和 cyclin D1等,從而影響免疫、炎癥和細(xì)胞周期調(diào)控等[5]?；虬邢?qū)嶒炞C實,IKKβ是促炎因子激活NF-κ B必需的IKK亞基,所有激活 IKK的因素均直接影響NF-κ B的活化[6]。

為了進一步研究此基因的功能及其在NF-κ B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的具體作用,我們用IKKβ的特異引物通過RT-PCR方法從人正常肝細(xì)胞L02中釣取了IKKβ的全長表達序列,并克隆入真核表達載體進行表達。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

pcDNA3.1質(zhì)粒、L02細(xì)胞及HEK293細(xì)胞由東北師范大學(xué)遺傳與細(xì)胞研究所提供;兔抗IKKβ多克隆抗體購自Santa Cruz公司;TRIzol試劑及逆轉(zhuǎn)錄試劑均購自GIBCOBRL公司;限制性內(nèi)切酶HindⅢ、KpnⅠ、Taq DNA聚合酶及T4連接酶購自TAKARA公司;膠回收試劑盒購自Vitagen公司;Transfast轉(zhuǎn)染試劑購自Promega公司;ECL購自Amersham pharmacia公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取

將人正常肝細(xì)胞L02在12孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)至對數(shù)生長期,用冷PBS洗滌后,每孔加入Trizol 1 ml,吹打均勻后加入200 μ l氯仿,混勻,4℃,12 000 rpm,離心15分鐘,取上清,然后加入500 μ l異丙醇沉淀,混勻后,室溫放置10分鐘,4℃,12 000 rpm,離心10分鐘,沉淀用70%乙醇洗一次,4℃,7 500 rpm離心10分鐘,沉淀用真空抽干,溶于20 μ l DEPC水中備用。

1.2.2 RT-PCR

取總 RNA 5 μ g 用 DEPC 水調(diào)整至 14.25 μ l,然后加入Oligo-dT 1μ l,70℃,2分鐘后置于冰上,加入5 μ l反應(yīng)緩沖液 ,2.5 μ l 2.5 mM dNTP,1.25 μ l 0.1 M DTT,1 μ l逆 轉(zhuǎn)錄酶,37℃,90 分鐘 ,然后加入 75 μ l DEPC水。取5 μ l反應(yīng)產(chǎn)物做模板,用特異性 IKKβ引物進行PCR反應(yīng)。上游端引物:5′-CCAAGCTTCCACCATGAGCTGGTCAC-3′下游端引物 :5′-GGGGTAC CTGAGGCCTGCTCCAGGC-3′。上游端及下游端引物中分別含有HindⅢ和KpnⅠ酶切位點。將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,在紫外燈照射下切取目的片段,用凝膠回收試劑盒回收目的DNA片段。

1.2.3 pcDNA3-IKKβ體的構(gòu)建及鑒定

將回收的IKKβcDNA片段及pcDNA3.1載體分別用HindⅢ和KpnⅠ雙酶切后回收目的片段,將回收的片段及質(zhì)粒用T4 DNA連接酶進行連接,16℃連接過夜。用上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌,涂平板,次日挑取單個克隆進行擴增并提取質(zhì)粒。將提取的重組質(zhì)粒以及載體pcDNA3.1分別用HindⅢ和KpnⅠ雙酶切。將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒進行測序鑒定。

1.2.4 用重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞

將HEK293細(xì)胞鋪入6孔板,每孔3×105個細(xì)胞,37℃5%CO2孵箱培養(yǎng)。次日用PBS將細(xì)胞洗一次待用。取兩只離心管,各加入2 ml DMEM無血清培養(yǎng)基,分別加入pcDNA3.1及pcDNA3-IKKβ質(zhì)粒各 3 μ g,然后加入 9 μ l Transfast 轉(zhuǎn)染試劑,渦旋混勻20秒,室溫靜置15分鐘,然后加入6孔板中,37℃5%CO2孵箱培養(yǎng)1小時后,每孔加入2 ml DMEM完全培養(yǎng)基。37℃5%CO2孵箱培養(yǎng)48小時。

圖1 PCR擴增IKK β全長表達序列

圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

圖3 IKK β在真核細(xì)胞中的表達

1.2.5 免疫印跡法檢測重組質(zhì)粒的表達

將轉(zhuǎn)染后的HEK293細(xì)胞用PBS洗滌后,每孔加入100 μ l含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液(50 mM Tris-HCl(pH7.5),150 mM NaCl,1 mM NaF,0.5%NP-40,Aprotinin 2 μ g/ml,1 mM PMSF)。用加樣器吹打后移至離心管中,冰上放置20分鐘后4℃離心20分鐘,將上清液移至新的離心管中。在HEK293細(xì)胞裂解物中加入等體積的上樣緩沖液,煮沸10分鐘后放于冰上冷卻,將此混合液加至SDS-PAGE凝膠上電泳分離,然后電轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。將此膜用抗IKKβ多克隆抗體雜交,之后用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作用,最后加入ECL,通過使X光膠片曝光來鑒定蛋白的表達情況。

2 結(jié)果

2.1 RNA提取及RT-PCR

用Trizol提取L02細(xì)胞總RNA,并以此總RNA為模板,利用IKKβ特異性引物通過RT-PCR方法擴增出一條2 270 bp左右的DNA片段(見圖1),與理論推測的IKKβ表達序列的大小一致。

2.2 pcDNA3.1-IKKβ重組質(zhì)粒的連接及鑒定

將PCR片段用HindⅢ和KpnⅠ雙酶切,回收IKKβ片段,同時將pcDNA3.1用同樣的酶酶切后進行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α后提取質(zhì)粒,將提取的質(zhì)粒用HindⅢ和KpnⅠ雙酶切鑒定。結(jié)果如圖2所示,重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后出現(xiàn)一個載體片段及一個2 270 bp左右的DNA片段。將此質(zhì)粒送至上海聯(lián)合基因公司進行測序。結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

2.3 免疫印跡法檢測IKKβ的表達

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中,將細(xì)胞裂解液通過SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,然后用抗IKKβ多克隆抗體及酶標(biāo)羊抗兔抗體進行免疫印跡分析,通過ECL試劑發(fā)光后使X光膠片顯影。結(jié)果如圖3所示,對照HEK293中僅有少量內(nèi)源性IKKβ蛋白表達,而轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒的細(xì)胞中則有大量IKKβ蛋白表達,說明重組質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中可有效表達IKKβ蛋白。

3 討論

NF-κ B是一種重要的二聚體核轉(zhuǎn)錄因子,存在于多種細(xì)胞中,參與細(xì)胞的黏附、炎性細(xì)胞的趨化、增殖等多種生理、病理過程中相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄,具有重要的生理和病理意義[7-9]。Iκ B激酶(IKK)是NF-κ B信號系統(tǒng)上游的一個關(guān)鍵激酶,在絕大多數(shù)情況下是NF-κ B激活的共同通路。在未激活條件下,NF-κ B與其抑制物Iκ B以無活性的復(fù)合物形式存在于胞漿中。當(dāng)細(xì)胞受到胞外信號刺激時,通過一個或多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,激活一系列激酶,使 Iκ B N端兩個特異性位點的絲氨酸磷酸化,隨后賴氨酸殘基發(fā)生泛素化,最后,在26S蛋白酶體的作用下,Iκ B降解,NF-κ B與 Iκ B 發(fā)生解離,并迅速從細(xì)胞漿移至細(xì)胞核,與靶基因上的κ B位點發(fā)生特異性結(jié)合,調(diào)控相應(yīng)的基因表達。在此過程中,IKK是最關(guān)鍵的激酶。IKK包括IKKα和IKKβ,其多肽分為激酶區(qū)、亮氨酸拉鏈樣結(jié)構(gòu)和螺旋環(huán)狀結(jié)構(gòu)。IKK被抑制則使NF-κ B不能轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核內(nèi),從而不能發(fā)揮促轉(zhuǎn)錄和調(diào)控細(xì)胞各種活動的功能[10-11]。本研究采取RT-PCR方法,從人肝細(xì)胞L02中成功釣取了IKKβ全長cDNA序列,并將其克隆入真核表達載體中進行表達,為進一步研究NF-κ B的信號傳遞機制奠定了基礎(chǔ)。

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Construction of eukaryotic vector of inhibitor of kappa B kinase β and expression in HEK293 cells

ZHANGDong-mei,YANG Mei-ting,LIU Ying,et al.(National Engineering Laboratory forDruggable Gene and Protein Screening,Northeast Normal University,Changchun130024,China)

ObjectiveConstruct the inhibitor of kappa B kinase β recombinant eukaryotic expression vector,in order to further investigate the biological function of IKKβ.MethodsExtract total RNA from human liver cell L02 and amplify IKKβ cDNA by RTPCR using specific primers.Then the cDNA was inserted into vector pcDNA3 to construct the recombinant vector pcDNA-IKKβ,then the recombinant vector was transfectedinto human embryonic kidney cellHEK293 and the protein expression was detected by western blot.ResultsEnzyme restriction and sequencing data indicated that the recombinant vector was constructed exactly,western blot result shown that the IKKβ recombinant eukaryotic expression vector can efficiently express IKK β in HEK293 cells.ConclusionThe eukaryotic expression vector pcDNA3-IKKβ is constructed and expresses in HEK293 cells successfully,which establish the foundation for future research on IKK β gene function.

IKKβ;construction of expression vector;eukaryotic expression

G78

A

1007-4287(2010)07-0977-03

國家自然科學(xué)基金項目(30672068),吉林省科技發(fā)展計劃項目(200805131)

*通訊作者

鮑永利,女,42歲,博士學(xué)位,教授,博士生導(dǎo)師,主要研究方向為腫瘤發(fā)生機制研究及抗腫瘤新藥研發(fā)。

2009-12-28)