楊 嵐,李 蕾,許 飛,帥朝霞,陳國千*

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫婦幼保健院檢驗科,江蘇無錫 214002;2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科;3.皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗科)

TNF參與內(nèi)毒素誘導(dǎo)肥大細(xì)胞HMGB1釋放

楊 嵐1,李 蕾2,許 飛1,帥朝霞3,陳國千2*

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫婦幼保健院檢驗科,江蘇無錫 214002;2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科;3.皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗科)

目的探討腫瘤壞死因子-α(TNF-α)在內(nèi)毒素誘導(dǎo)肥大細(xì)胞高遷移率族蛋白B1(HMGB1)釋放中的作用。方法采用小鼠肥大細(xì)胞株P(guān)815培養(yǎng)物,觀察100 μ g/L脂多糖(LPS)誘導(dǎo)后培養(yǎng)上清液中HMGB1、TNF-α含量的變化,不同劑量抗TNF-α中和抗體IgG對 LPS誘導(dǎo)HMGB1釋放的影響,及TNF-α對HMGB1釋放的誘導(dǎo)作用。HMGB1含量采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測。結(jié)果培養(yǎng)上清液中HMGB1含量隨LPS誘導(dǎo)時間而升高,而TNF-α含量于誘導(dǎo)6 h時達(dá)到峰值;5、25 mg/L抗TNF-α抗體對LPS誘導(dǎo)HMGB1釋放有明顯的抑制作用(P＜0.05);TNF-α顯示具有誘導(dǎo)肥大細(xì)胞釋放HMGB1的作用,并呈時間、劑量相關(guān)性。結(jié)論TNF-α參與內(nèi)毒素誘導(dǎo)肥大細(xì)胞釋放HMGB1的過程。

高遷移率族蛋白B1;肥大細(xì)胞;內(nèi)毒素;腫瘤壞死因子-α

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0985)

肥大細(xì)胞為體內(nèi)的一種重要免疫細(xì)胞。近年研究[1-4]顯示,肥大細(xì)胞在內(nèi)毒素作用下,釋放腫瘤壞死因子(TNF)、白介素、組胺等多種細(xì)胞因子或生物活性介質(zhì),參與急慢性炎癥反應(yīng)。胞外高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)作為近年發(fā)現(xiàn)的一種重要晚期炎癥介質(zhì),受到廣泛關(guān)注和重視[5];多種組織細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞等受內(nèi)毒素等激活后釋放HMGB1,參與諸多疾病如膿毒癥、關(guān)節(jié)炎、急性胰腺炎、肺炎等的發(fā)病過程[6-9]。我們最近研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)毒素能誘導(dǎo)肥大細(xì)胞釋放HMGB1,為了解TNF-α在內(nèi)毒素誘導(dǎo)HMGB1釋放中的作用,進行如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠肥大細(xì)胞株P(guān)815購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。脂多糖(LPS)、小鼠 TNF-α和羊 IgG(正常對照)為Sigma公司產(chǎn)品,羊抗小鼠TNF-α抗體 IgG和小鼠TNF-αELISA試劑盒為 R&D公司產(chǎn)品,HMGB1 ELISA試劑盒為Shino-Test公司產(chǎn)品,RPMI 1640和OPTI-MEM I培養(yǎng)液為Gibco公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)細(xì)胞實驗 小鼠肥大細(xì)胞株P(guān)815以含10%新生牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),實驗前2 h用無血清OPTIMEM I培養(yǎng)液置換,并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×106/ml。誘導(dǎo)一定時間后,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,保存于-20℃待測。實驗均重復(fù)5次。

1.2.2 HMGB1、TNF-α含量測定 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HMGB1、TNF-α含量采用ELISA試劑盒檢測,按產(chǎn)品使用說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件包進行雙側(cè) t檢驗分析和多樣本均數(shù)間兩兩比較(Dunnett-t檢驗法),P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS對肥大細(xì)胞HMGB1、TNF-α釋放的誘導(dǎo)作用

小鼠肥大細(xì)胞株P(guān)815經(jīng)100 μ g/L LPS誘導(dǎo)后,培養(yǎng)上清液中HMGB1含量于6 h時顯示升高,并隨時間延長而進一步升高,TNF-α含量于6 h時達(dá)峰值,隨后逐漸降低(圖1)。通過臺盼藍(lán)細(xì)胞染色顯示,100 μ g/L LPS對肥大細(xì)胞株P(guān)815未見明顯細(xì)胞毒作用。

2.2 抗TNF-α抗體對LPS誘導(dǎo)肥大細(xì)胞HMGB1釋放的影響

5、25 mg/L 抗 TNF-α抗體 IgG 對 100 μ g/L LPS誘導(dǎo)(24 h)小鼠肥大細(xì)胞株P(guān)815的HMGB1釋放顯示明顯的抑制作用(P＜0.05),后者抑制率為40.1%,而正常對照IgG沒有影響(P＞0.05)(圖2)。

圖1 脂多糖誘導(dǎo)后肥大細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HMGB1和TNF-α含量的變化

圖2 抗TNF-α抗體對脂多糖誘導(dǎo)肥大細(xì)胞HMGB1釋放的影響

2.3 TNF-α對肥大細(xì)胞HMGB1釋放的誘導(dǎo)作用

2、10 μ g/L TNF-α均顯示能誘導(dǎo)小鼠肥大細(xì)胞株P(guān)815釋放HMGB1,并呈時間、劑量相關(guān)性,10 μ g/L TNF-α對肥大細(xì)胞株P(guān)815釋放HMGB1的誘導(dǎo)作用(6、12、24 h)明顯強于 2 μ g/L TNF-α(P ＜0.01)(表1)。

表1 TNF-α誘導(dǎo)后肥大細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HMGB1含量的變化(μ g/L,n=5,±s)

表1 TNF-α誘導(dǎo)后肥大細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HMGB1含量的變化(μ g/L,n=5,±s)

與TNF-α 2 μ g/L組比較,*P＜0.01

組別 誘導(dǎo)時間2 h 6 h 12 h 24 h TNF-α2μ g/L 0 3.6±0.8 6.1±1.6 7.8±1.5 TNF-α10 μ g/L 0 7.6±1.8*14.6±3.1* 16.3±3.7*

3 討論

HMGB1為一種非組蛋白,廣泛分布于各種組織細(xì)胞中,主要存在于胞核,分子量約為3萬道爾頓,因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的高遷移能力而得名。1999年,Wang等[6]發(fā)現(xiàn)HMGB1可以釋放到胞外并介導(dǎo)炎癥反應(yīng),為內(nèi)毒素血癥和膿毒癥的重要炎癥介質(zhì)。隨后諸多研究[5,8,9]表明,炎癥介質(zhì)HMGB1還參與關(guān)節(jié)炎、急性胰腺炎、肺炎、腦膜炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、動脈粥樣硬化、燙傷、機械外傷、缺血再灌注損傷等的病理過程。LPS可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞等釋放HMGB1[5-7],但對肥大細(xì)胞HMGB1釋放的誘導(dǎo)作用尚未見報道。動物實驗和細(xì)胞實驗結(jié)果顯示,LPS誘導(dǎo)HMGB1釋放要晚于TNF-α、白介素-1等細(xì)胞因子的產(chǎn)生,因此,HMGB1被認(rèn)為是一種晚期炎癥介質(zhì)[6,10]。

肥大細(xì)胞作為一種重要的機體免疫細(xì)胞,廣泛分布于全身結(jié)締組織中,不僅在超敏反應(yīng)中起重要作用,也參與急慢性炎癥反應(yīng)。近年一些研究[1-4]顯示,LPS可誘導(dǎo)肥大細(xì)胞釋放TNF-α、白介素-4、白介素-5、白介素-6、白介素-10、白介素-13、組胺等多種細(xì)胞因子或生物活性介質(zhì)。最近Passante等[11]報道RBL-2H3肥大細(xì)胞不宜用于介質(zhì)釋放的研究。為了探討LPS誘導(dǎo)后肥大細(xì)胞是否釋放HMGB1,本研究使用小鼠肥大細(xì)胞株P(guān)815實驗,結(jié)果顯示肥大細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)后HMGB1釋放明顯增多,提示炎癥介質(zhì)HMGB1參與肥大細(xì)胞在內(nèi)毒素介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的作用;同時,結(jié)果也表明LPS激活肥大細(xì)胞后,誘導(dǎo)產(chǎn)生的HMGB1峰值明顯晚于TNF-α,與在其它種類細(xì)胞中觀察到的現(xiàn)象[10]一致。

細(xì)胞受LPS等激活后,胞內(nèi)HMGB1因缺乏引導(dǎo)肽結(jié)構(gòu)而不能以高爾基體/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑但可通過非經(jīng)典途徑釋放到胞外,其釋放機制還未完全清楚。胥彩林等[12]研究顯示核轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與LPS介導(dǎo)多種器官組織HMGB1基因表達(dá)的調(diào)控過程,最近Kim[13]和張健[14]等報道LPS誘導(dǎo)HMGB1釋放涉及JAK/STAT通路,但“早期”的致炎細(xì)胞因子TNF-α是否參與LPS誘導(dǎo)晚期炎癥介質(zhì)HMGB1釋放過程研究甚少。Wang等[15]和Wahamaa等[16]分別報道,TNF-α誘導(dǎo)垂體細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放HMGB1,我們近年研究[17]表明LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞HMGB1釋放與CD14、TNF-α依賴途徑有關(guān)。本研究結(jié)果顯示,TNF-α對肥大細(xì)胞釋放HMGB1具有誘導(dǎo)作用,使用抗TNF-α中和抗體能部分抑制LPS誘導(dǎo)后肥大細(xì)胞的HMGB1釋放,表明內(nèi)毒素誘導(dǎo)肥大細(xì)胞釋放HMGB1部分與TNF-α有關(guān)。

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Involvement of TNF in HMGB1 release of lipopolysaccharide-induced mast cells

YANGLan,LI Lei,XU Fei,et al.(Department of Clinical Laboratory,Wuxi Maternal and Child Health Hospital Affiliated to NJMU,Wuxi214002,China)

ObjectiveTo study the effect of TNF-αin extracellular release of high mobility groupbox 1(HMGB1)in endotoxininduced mast cells.MethodsThe concentrations of HMGB1 andTNF-αin the culture mediumwere analysed by ELISA,and the effect of anti-TNF-αneutralizing antibody with various concentrations was observed on HMGB1 release,after P815 mast cells were induced with 100 μ g/L lipopolysaccharide(LPS).HMGB1 release was investigated in P815 mast cells induced by mouse TNF-α.ResultsHMGB1 level in the culture medium time-dependently increased after mast cells were inducedwith LPS,andTNF-αlevel tended to peak 6 hours after induction.Anti-TNF-αantibody with 5 mg/L and 25 mg/L significantly inhibited LPS-induced production of HMGB1 by mast cells(P＜0.05).TNF-αdose-and time-dependently induced extracellular release of HMGB1.ConclusionEndotoxin induces mast cells to release HMGB1 partly through TNF-α-dependent mechanism.

HMGB1 protein;mast cells;endotoxin;tumor necrosis factor-alpha

R392.1

A

1007-4287(2010)07-0985-03

江蘇省自然科學(xué)基金(BK2006027);教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金

*通訊作者

楊嵐(1979-),女,碩士研究生,研究方向:炎癥介質(zhì)高遷移率族蛋白B1的基礎(chǔ)和臨床。陳國千,博士生導(dǎo)師,教授。

2010-01-17)