隋小芳,范巧菊,陳桂芝

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院老年病二科,黑龍江佳木斯 154002)

缺血預處理對大鼠局灶性腦損傷后線粒體Ca2+、細胞色素C的影響

隋小芳,范巧菊,陳桂芝

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院老年病二科,黑龍江佳木斯 154002)

目的觀察缺血預處理對大鼠局灶性腦損傷后線粒體Ca2+、細胞色素C的影響。方法用大鼠右側(cè)大腦中動脈阻閉制成局灶性腦缺血模型。24只大鼠,每組8只,隨機分為缺血預處理組、模型組和假手術(shù)組。缺血預處理組給予30 min預缺血,72 h再灌注,后續(xù)2 h缺血,4 h再灌注。用張均田的改良方法測定細胞色素C含量。用火焰原子吸收法檢測線粒體Ca2+含量。結(jié)果缺血預處理組動物的細胞色素C、Ca2+,與假手術(shù)組相比差異顯著(P＜0.05,P＜0.01),缺血預處理組與模型組相比差異顯著(P＜0.05,P＜0.01)。結(jié)論缺血預處理減少線粒體釋放細胞色素C,維持線粒體Ca2+穩(wěn)態(tài)

腦缺血;缺血耐受;線粒體;細胞色素C;Ca2+穩(wěn)態(tài)

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0994)

腦缺血耐受(CIT)由Kitagawa等[1]1990年在沙土鼠前腦缺血模型中發(fā)現(xiàn),對隨后的腦缺血損傷產(chǎn)生保護作用,雖然研究較晚,但是保護作用明確,從而為人們對腦缺血防治的認識,開辟了新的領域。本研究用Longa等[2]改良方法制成局灶性腦缺血模型(MCAO),觀察缺血預處理對線粒體Ca2+、細胞色素C(CytC)的影響,進一步探討缺血預處理(IP)發(fā)生機制。為缺血性腦血管疾病、中樞血管手術(shù)等可能的臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物及分組 雄性Wistar大鼠24只,體重260±30 g,由佳木斯實驗動物中心提供。動物隨機分為3組:缺血預處理,在缺血再灌注前3 d行30 min的預缺血;模型組,缺血2 h再灌注4 h;假手術(shù)組。

1.2 方法

1.2.1 局灶性腦缺血模型(MCAO) 大鼠術(shù)前禁食12 h,禁水4 h。10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉,用烤燈維持體溫在37-37.5℃。頸正中切口,暴露、剝離頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈,結(jié)扎頸總動脈、頸外動脈,于頸總動脈下方剪一切口。將一預先制作前端鈍圓的魚線,置入頸內(nèi)動脈18±0.5 mm,直至大腦前動脈近端,有輕微阻力感為止。阻閉完成后魚線抽出1 cm以恢復再灌注。

1.2.2 神經(jīng)功能損傷評分 動物麻醉蘇醒后,回籠,自由飲食。采用Zealonga評分法,0分:無神經(jīng)系統(tǒng)功能缺失癥狀,活動正常者;1分:不能完全伸展對側(cè)前爪者;2分:爬行時出現(xiàn)向左轉(zhuǎn)圈者;3分:行走時身體向偏癱側(cè)傾倒者;4分:不能自發(fā)行走,意識喪失者。評分為0分和4分者均被剔除。

1.2.3 腦線粒體的制備 動物用乙醚深麻醉,斷頭處死,取出腦組織,冷生理鹽水沖洗,濾紙擦干。每克腦組織加入9 ml預冷的分離介質(zhì)(0.1 mol/lTris-Hcl PH=7.4,1mmol/lkcl,0.25 mol/l蔗糖)。用電動玻璃勻漿機勻漿后,制成10%勻漿,低溫離心(600 g/min,4℃)15 min,取上清液低溫離心(18 000 g/min,4℃)15 min,上清液為胞漿,留樣(CytC測定),沉淀加少量0.1 mol/llTris-Hcl PH=7.4,1 mmol/lkcl制成線粒體懸液。用雙縮脲法測定線粒體蛋白含量,各管蛋白均稀釋成0.2 mg/ml。

1.2.4 CytC的測定 采用改良的張均田法測定[3]。標準曲線測定,取0.1 mmol/lCytC標準品(上海維思化學試劑有限公司)0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 ml加蒸餾水至1.5 ml,再加幾毫克連二亞硫酸鈉,520 nm測光密度值,繪標準曲線。由樣品光密度值據(jù)標準曲線計算其濃度(胞漿直接測定,線粒體懸液破膜后測定)。

1.2.5 線粒體Ca2+測定 采用火焰原子吸收法。取線粒體懸液1.5 ml,置于10 ml加蓋刻度試管中,加入濃硝酸5 ml,陰暗處硝化一周。然后烘箱加熱,使硝酸盡量分解蒸發(fā),加入1%氯化鑭至10 ml。混勻,測吸收光密度,由標準曲線計算濃度。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺陷評分,缺血2 h后再灌注4 h,進行神經(jīng)功能缺陷評分見表1。

表1 各組神經(jīng)功能缺陷評分的比較(±s)

表1 各組神經(jīng)功能缺陷評分的比較(±s)

注:與模型組比較*為P＜0.05

組別 例數(shù) 評分假手術(shù)組 8 0模型組 8 1.9±0.6缺血預處理組 8 1.3±0.5*

2.2 各組實驗動物胞漿CytC、線粒體CytC和線粒體Ca2+含量見表2。

表2 各組胞漿 Cyt C、線粒體Cyt C、線粒體Ca2+的比較(±s,n=8)

表2 各組胞漿 Cyt C、線粒體Cyt C、線粒體Ca2+的比較(±s,n=8)

#P＜0.05##P＜0.01 vs sham operation group,*P＜0.05**P＜0.01 vs model group

Group Plasma Cyt C(μ mol/l) Motochondrial Cyt C(μ mol/l) Motochondrial Ca2+(μ mol/100 mg?pro)Sham operation 282.71±33.95 12.57±3.67 127.43±33.17 Model 346.19±37.72## 8.82±1.82# 76.53±17.58##Preischemic 286.39±27.59** 12.08±2.60* 112.38±20.03**

3 討論

本研究顯示:腦缺血2 h,再灌注4 h,胞漿CytC的濃度升高,而線粒體CytC濃度相應降低,這與Fujimur等[4]報道相一致。遲發(fā)性腦細胞死亡及腦缺血損傷邊緣區(qū),細胞的死亡形式以凋亡為主[7]。腦缺血細胞凋亡的引發(fā)與線粒體CytC移位至胞質(zhì)相對應[5]。線粒體CytC可通過膜通透轉(zhuǎn)運孔(permeabity transition pore,PTP)開放所致的外膜破裂而釋放,或者通過較大的電壓依賴性陰離子通道(VDAC)而釋放。Bcl-2s成員可在人造脂膜上形成離子通道。Bcl-2s也可促進或抑制VDAC的開放。CytC的再分布是caspase激活和DNA裂解的上游事件。IP時熱休克蛋白HSP70顯著增高,其可抑制CytC和dATP啟動的凋亡蛋白酶活化因子(apoptosis protease activating factor,Apaf-1)與caspase-9復合物的形成?？梢杂行ё枰旨毎蛲龅耐?。IP時促進凋亡和抑制凋亡基因均上調(diào)。尤其Bcl-2s調(diào)控CytC的釋放[6],而c-fos可通過HSP70基因表達發(fā)揮作用。Ca2+作為第二信使,其信號在胞漿、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、胞核和線粒體間傳遞,引發(fā)生物學效應。幾乎參與一切調(diào)控細胞功能的信息轉(zhuǎn)化過程,同時也是細胞內(nèi)代謝活動的重要元素。因此維持細胞漿、細胞器、細胞核Ca2+濃度對生命活動是至關重要的。許多使PTP開放的因素都要求有Ca2+存在[8,9]。Ca2+通過與腺苷轉(zhuǎn)運酶(ANT)結(jié)合改變其構(gòu)象,使PTP開放。ANT與親合素(Cyp-D)結(jié)合又增加PTP對Ca2+的敏感性,使更多的PTP開放,PTP發(fā)揮自放大效應。ADP或ATP與ANT結(jié)合能降低PTP對Ca2+的敏感性。在許多刺激因子的作用下,線粒體內(nèi)Ca2+含積聚,與ANT結(jié)合增多,PTP開放數(shù)量增加,積聚的Ca2+含釋放。最終細胞選擇那種死亡形式,由PTP開放后細胞內(nèi)ATP供應狀態(tài)決定。由此我們認為,預處理調(diào)節(jié)線粒體釋放細胞色素C,維持線粒體Ca2+穩(wěn)態(tài),通過此作用發(fā)揮IP的線粒體機制。IP通過不同時程、不同位點調(diào)控線粒體鈣穩(wěn)態(tài)及細胞色素C的釋放。闡明IP的保護機制,利于進一步認識TIA發(fā)作。為頸動脈和中樞血管手術(shù)提供理論依據(jù)。

[1]Katagawa K,Matsumoto M,Tagaya M,et al.Ischemic tolerance phenomenon found in the brain[J].Brain Res,1990,528(1):21.

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Effect of ischemic preconditioning on contents of cytochrome C and mitochondrial calcium in rats after focal cerebral is- chemic-reperfusion

SUI Xiao-fang,FAN Qiao-ju,CHEN Gui-zhi.(Department of OldAge,First Affiliated Hospital ofJiamusiUniversity,Jiamusi154002,China)

ObjectiveTo observe the effect of ischemic preconditioning on contents of cytochrome C and mitochondrial calcium in rats after focal cerebral ischemic-reperfusion.MethodsFocal cerebral ischemic model was made by occlusion of right middle artery in Wistar rats(ischemia for 2 h and reperfusion for 4h).Ratswere randomly divided into three groups:preischemia、model and sham operation.Rats in preischemia group were undergone transient ischemic preconditioning(30 min)and reperfusion(72 h).The contents of cytochrome C were measured according to Zhangjuntian'simproved means.The contents ofmitochondrial calcium were detected by flame atom absorption.ResultsThe contents of mitochondrial cytochrome C and calcium in model groupwere significantly lower than sham operation(P＜0.05,P＜0.01),whereas the contentsof plasma cytochrome Cwere markly higher(P＜0.05,P＜0.01).The change in preischemia groupwas obviously difference as comparedwith the model group.ConclusionIschemic preconditioning reduced the release of mitochondrial cytochrome C and maintained mitochondrial calcium dyshomeostasis.

Cerebral ischemic;Ischemic tolerance;Mitochondria;Cytochrome C;Calcium dyshomeostasis

R743

A

1007-4287(2010)07-0994-03

2009-05-13)