盧秋維，李東明

(廣西壯族自治區(qū):1.人民醫(yī)院檢驗科;2.婦幼保健院優(yōu)生遺傳科，南寧 5300211)

β-珠蛋白生成障礙性貧血是廣西地區(qū)危害最大的血紅蛋白病，目前尚缺少有效的治療方法，尤其是重型β-珠蛋白生成障礙性貧血患兒要靠輸血維持生命，給家庭和社會帶來沉重的負擔[1-3]。因此，對夫婦雙方為β-珠蛋白生成障礙性貧血基因攜帶的孕婦進行產(chǎn)前診斷，是防止此類患兒出生的有效措施。但因母體血污染導致重型珠蛋白生成障礙性貧血胎兒的誤診或漏診時有發(fā)生[4-5]，為此本研究對羊水細胞進行原位培養(yǎng)，采用培養(yǎng)后細胞進行β-珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測，避免了反復取材，提高了診斷的準確性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 夫婦均為β-珠蛋白生成障礙性貧血基因攜帶的妊娠426例，其中曾生育重型β-珠蛋白生成障礙性貧血患兒者105例，有重型β-珠蛋白生成障礙性貧血胎兒引產(chǎn)史者17例，接受遺傳、產(chǎn)前咨詢者 304例。夫婦雙方合并α-珠蛋白生成障礙性貧血雜合子37例。

1.2 標本采集及細胞培養(yǎng) 在孕13～28周，B超引導下行羊膜腔穿刺抽取羊水10～15 m L，置兩支15 m L無菌離心管中，血性羊水加入EDTA-K2抗凝。將1管羊水離心，棄上清液，留下1 m L左右;混勻后吸入裝有 3 m L AM-Ⅱ(美國GIBCO公司)培養(yǎng)基的原位培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7 d后，置倒置顯微鏡下觀察，當出現(xiàn) 3～5個細胞克隆后，換掉培養(yǎng)液，當出現(xiàn)大量貼壁細胞時，用生理鹽水反復清洗后，轉(zhuǎn)移到1.5 m L EP管內(nèi)備用。

1.3 珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測 對培養(yǎng)后細胞采用快速DNA提取試劑盒(深圳益生堂公司)進行DNA提取，采用單管多重PC R體系進行珠蛋白生成障礙性貧血基因擴增，結(jié)合反向點雜交技術檢測17種β和3種α-珠蛋白基因突變類型，限制性酶切結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳技術檢測3種α-珠蛋白基因缺失類型，按試劑盒說明書進行操作及結(jié)果判斷。

2 結(jié) 果

426例羊水標本，其中血性羊水2例，離心后肉眼可見血細胞6例，鏡下可見血細胞 13例，均培養(yǎng)成功，共檢出β-珠蛋白生成障礙性貧血302例，見表1。同時檢出 Hb Bart′s水腫胎9例，其中復合β-珠蛋白生成障礙性貧血雙重雜合子4例;Hb H病1例;α-珠蛋白生成障礙性貧血雜合子17例，其中復合β-珠蛋白生成障礙性貧血純合子1例，雙重雜合子3例。21例母體血污染標本，檢出β-珠蛋白生成障礙性貧血16例，其中β-珠蛋白生成障礙性貧血純合子1例;雙重雜合子5例，包括復合Hb Bart′s水腫胎1例;雜合子10例，包括復合α-珠蛋白生成障礙性貧血雜合子2例。另檢出α-珠蛋白生成障礙性貧血雜合子1例。終止妊娠107例，在本院引產(chǎn)或分娩的胎兒均經(jīng)驗證，結(jié)果相符，隨訪238例，無畸形。

表1 培養(yǎng)后細胞β-珠蛋白生成障礙性貧血基因診斷結(jié)果

3 討 論

β-珠蛋白生成障礙性貧血是β-珠蛋白基因缺失或突變導致血紅蛋白的珠蛋白肽鏈缺失或合成減少引起的溶血性遺傳病。若夫婦雙方為同型珠蛋白生成障礙性貧血基因攜帶者，每次妊娠胎兒有25%為重型珠蛋白生成障礙性貧血兒。因此，對高風險人群進行產(chǎn)前基因診斷有著重大意義[2，6]。目前，進行胎兒基因診斷的取材方法主要有3種:經(jīng)腹腔或?qū)m頸絨毛活檢術、羊膜腔穿刺術和經(jīng)腹臍帶穿刺術。前者技術難度較大，1次取材成功率不高，且可增加胎兒畸形的發(fā)生率，易受蛻膜細胞污染造成誤診[7-8]。羊膜腔穿刺術具有操作簡便、并發(fā)癥少等優(yōu)點，是臨床應用最廣泛的取材方法[9]。臍帶穿刺術操作難度較大，診斷時間也較晚，不易發(fā)現(xiàn)少量母血污染[10]。本組426例孕婦行羊膜腔穿刺術取羊水，進行珠蛋白生成障礙性貧血產(chǎn)前基因診斷，穿刺成功率為100%，無嚴重并發(fā)癥發(fā)生。

羊膜腔穿刺過程中難以避免母體血的污染，而不能檢測或再次取樣[11];當標本僅有極少量母體血污染，尤其是肉眼或離心后仍不可見時，易導致誤診[12]?；谔貉蛩毎N壁生長，而血細胞不貼壁生長的特點，本研究應用細胞原位培養(yǎng)法對羊水細胞進行培養(yǎng)，采用培養(yǎng)后細胞進行珠蛋白生成障礙性貧血產(chǎn)前基因診斷。426例標本均培養(yǎng)成功，共檢出β-珠蛋白生成障礙性貧血302例(70.89%)，其中純合子31例，雙重雜合子70例，與國內(nèi)外報道相近[7，13]，也與東南亞地區(qū)為珠蛋白生成障礙性貧血高發(fā)區(qū)相一致。同時檢出α-珠蛋白生成障礙性貧血27例，其中重型α-珠蛋白生成障礙性貧血10例，包括復合重型β-珠蛋白生成障礙性貧血8例，與陳萍等[5]報道類似。值得注意的是夫婦雙方為α復合β-珠蛋白生成障礙性貧血的孕婦中，因重型珠蛋白生成障礙性貧血引產(chǎn)或生育史而行產(chǎn)前診斷者有17例，此次診斷為重型珠蛋白生成障礙性貧血者有5例，其中1例已有3次重型珠蛋白生成障礙性貧血孕、育史。為避免該類患兒的出生而再次終止妊娠，建議這類夫婦進行植入前產(chǎn)前診斷[14-15]，這對降低出生缺陷有重要意義。

值得注意的是，本研究 426例標本中，離心前、后肉眼可見母體血細胞污染標本8例，細胞培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)13例，在顯微鏡下仍可見一定數(shù)量的血細胞;當羊水細胞貼壁后，保留換出的培養(yǎng)液。對檢測結(jié)果為β-珠蛋白生成障礙性貧血純合子和雜合子且與孕婦基因型不同的5例，再用換出的培養(yǎng)液提取DNA進行檢測，僅有1例仍為β-珠蛋白生成障礙性貧血雜合子。考慮可能該標本中的血細胞較少，以及提取過程中的丟失，導致該標本中的母親基因型未被擴增出來。表明當有母體血污染時，尤其是肉眼不可見或離心后仍不可見的少量母體血污染的標本，一旦被擴增出來，可導致雜合子誤診為β-珠蛋白生成障礙性貧血雙重雜合子或漏診β-珠蛋白生成障礙性貧血純合子[9]。同樣，若夫婦雙方為東南亞缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血攜帶者，當有母體血污染時，Hb Bart′s水腫胎可誤診為東南亞缺失型[12]。因細胞培養(yǎng)技術難度較大，故對不具備細胞培養(yǎng)條件的基層醫(yī)院，應對羊水細胞離心后在顯微鏡下進行分析，減少母體血污染導致的誤診。

綜上所述，為了減少珠蛋白生成障礙性貧血患兒的出生，應加強孕齡人群珠蛋白生成障礙性貧血產(chǎn)前篩查和基因確診[16-17]。對夫婦為同型基因攜帶者，在孕中期行羊膜腔穿刺術獲取羊水細胞，對羊水細胞進行原位培養(yǎng)，所需標本量較少，培養(yǎng)成功率高。采用培養(yǎng)后細胞進行珠蛋白生成障礙性貧血基因診斷，可避免母體血污染導致的誤診，提高產(chǎn)前診斷的準確性;同時避免多次取材，減少流產(chǎn)的發(fā)生。

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