羅岸

摘要：利用少量細(xì)胞分離技術(shù)和RT-PCR技術(shù)，在煙草合子中克隆到一種新型胱硫醚-γ-合成酶基因，命名為NtCGS-4。序列分析顯示新基因開放性閱讀框長度為1 611 bp，編碼537個氨基酸，預(yù)測分子質(zhì)量為57.931 2 ku，等電點為6.15。利用染色體步移技術(shù)獲得該基因5′上游2 696 bp的側(cè)翼序列（啟動子和5′UTR）。系統(tǒng)進化分析表明，該基因與多種農(nóng)作物的胱硫醚-γ-合成酶基因具有較高同源性。煙草新型胱硫醚-γ-合成酶NtCGS-4可能在煙草早期胚胎發(fā)生中參與甲硫氨酸的生物合成和代謝。

關(guān)鍵詞：煙草；胱硫醚-γ-合成酶；基因克??；甲硫氨酸；合子

中圖分類號：S572；Q781 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）11-2651-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.024

Detection and Analysis of a New Type of Cystathionine-γ-synthase in Nicotiana tabacum

LUO An

（College of Life Sciences， Yangtze University， Jingzhou 434023， Hubei， China）

Abstract： By application of the reverse transcription PCR（RT-PCR） in small amount of cells，a new type cystathionine-γ-synthase （CGS） gene was found in tobacco zygote，named as NtCGS-4.The analysis showed that the CDS sequence of NtCGS-4 was 1 611 bp，encoding a polypeptide of 537 amino acid residues with a predicted molecular weight of 57.931 2 ku and the theoretical PI was 6.15. 2 696 bp sequence of the 5′ flanking region（promoter and 5′UTR） of NtCGS-4 was obtained by genome walking.The phylogenetic tree revealed that NtCGS-4 had a high homology with CGS gene from multiple crops. The new type cystathionine-γ-synthase（CGS） gene NtCGS-4 may be involved in the biosynthesis and metabolism of methionine in early embryogenesis of tobacco.

Key words： tobacco； cystathionine-γ-synthase； gene cloning； methionine； zygote

含有硫元素的甲硫氨酸屬于人類和家畜的必需氨基酸之一，其含量與農(nóng)作物的營養(yǎng)價值息息相關(guān)[1]。此外甲硫氨酸除了參與蛋白質(zhì)組成和mRNA翻譯起始外，還能通過一些代謝產(chǎn)物間接調(diào)控許多細(xì)胞生命活動，比如參與細(xì)胞分裂、細(xì)胞壁形成、葉綠體和細(xì)胞膜合成[2]，參與調(diào)控成熟和衰老等過程[3，4]，參與體內(nèi)平衡和基因表達[5]，以及參與對病菌和昆蟲的防御等[6，7]。

胱硫醚-γ-合成酶（CGS）是甲硫氨酸生物合成途徑中的一個關(guān)鍵酶，其表達受到底物的反饋抑制。嚴(yán)密精確的調(diào)控對于植物胱硫醚-γ-合成酶的表達來說非常重要。擬南芥中胱硫醚-γ-合成酶的下調(diào)會導(dǎo)致嚴(yán)重的生長延遲現(xiàn)象，影響植物的頂端優(yōu)勢和花器官的發(fā)育，此外也會明顯降低葉綠體的含量[8，9]。而在擬南芥、馬鈴薯、番茄中過量的胱硫醚-γ-合成酶引起的過高的甲硫氨酸含量同樣會導(dǎo)致這些植物不正常的表型[10-11]。

目前對植物中參與甲硫氨酸代謝的調(diào)控因子的研究主要集中在營養(yǎng)組織中，在種子中的研究則很少。為此，利用NCBI的數(shù)據(jù)庫獲得已知的煙草胱硫醚-γ-合成酶基因的序列信息，以此設(shè)計引物檢測到在煙草合子中存在一種新型胱硫醚-γ-合成酶基因NtCGS-4的表達。并通過染色體步移技術(shù)獲得了NtCGS-4基因的5′側(cè)翼序列（啟動子和5′UTR）。新獲得的在煙草早期胚胎發(fā)生中表達的新型胱硫醚-γ-合成酶基因為進一步研究甲硫氨酸在植物種子發(fā)育中的生物學(xué)功能和調(diào)控機制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 試驗材料為野生型煙草（Nicotiana tabacum var. SR1），種植于長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院所屬溫室內(nèi)，室溫25 ℃，光照周期16 h/8 h。

1.1.2 主要試劑和質(zhì)粒 普通DNA片段回收試劑盒，瓊脂糖凝膠回收試劑盒，質(zhì)粒小提試劑盒（天根生化科技有限公司），DNeasy Plant Mini Kit試劑盒（QIAGEN公司），Universal GenomeWalker Kit試劑盒（Clontech公司），Dynalbeads mRNA DIRECT Micro kit 試劑盒（Life technologies公司），反轉(zhuǎn)錄酶SuperScripIII（Life technologies公司），DNA聚合酶Ex Taq（Takara公司），DNA聚合酶Phusion High-Fidelity DNA Polymerase（NEB公司），pGEM-T Easy vector（Promega公司），大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞為實驗室自制。

1.2 方法

1.2.1 煙草合子的分離 取人工授粉后96 h左右的SR1的胚珠用于合子分離，方法參照文獻[12]。將分離的合子收集至預(yù)先加入5 μL 2×Lysis/ Binding Buffer的PCR管中，管內(nèi)最終總體積不超過10 μL，-80 ℃冰箱保存。同時挑選部分合子以FDA（Fluorescein Diacetate）染色檢測活性，并使用Cooled CCD采集圖像。

1.2.2 合子cDNA的制作和基因片段的獲取 按照Dynalbeads mRNA DIRECT Micro kit試劑盒的要求提取合子的mRNA，并使用Superscript III反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈。使用Primer Premier 5軟件在NCBI提供的胱硫醚-γ-合成酶基因（KJ001150）序列兩端設(shè)計檢測引物（表1）進行PCR反應(yīng)，（98 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，39個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，于4 ℃保溫，Pushion高保真酶擴增）。凝膠檢測并測序。

1.2.3 NtCGS-4基因5′側(cè)翼序列的克隆 按照Universal GenomeWalker Kit試劑盒制作walking文庫，并按照要求設(shè)計GSP引物（表2）。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照試劑盒要求，引物退火溫度靈活掌握。經(jīng)過三輪擴增后序列無法繼續(xù)延伸，將序列拼接后進行檢測。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 利用ExPASy（http：//web.expasy.org）的Protparam預(yù)測蛋白質(zhì)的氨基酸組成和理論等電點。利用NCBI的blastx搜索NtCGS-4蛋白的同源氨基酸序列，利用軟件Clustalx 1.83進行同源比對，并用MEGA 4構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離煙草SR1的合子

利用酶解和玻璃棒擠壓能有效分離出授粉后96 h的SR1胚珠的胚囊，為了獲得干凈無母體組織污染的合子，則必須進行二次酶解才能將其徹底從胚囊中分離。從圖1可以看出，分離后的合子背景干凈，形態(tài)正常，沒有破裂。FDA是熒光素雙醋酸酯，本身并無熒光，其進入細(xì)胞內(nèi)后便產(chǎn)生熒光素。由于FDA不能自由進入細(xì)胞膜，所以有活力的細(xì)胞才能發(fā)出熒光。用FDA分離的合子進行染色發(fā)現(xiàn)其熒光強烈，這說明分離的合子狀態(tài)良好，具有較好的活性，可以用于下一步的mRNA的提取。

2.2 合子cDNA中胱硫醚-γ-合成酶基因的檢測

利用NCBI查詢到煙草胱硫醚-γ-合成酶基因（KJ001150）的cDNA序列有1 882 bp，含有一個1 620 bp的開放閱讀框。分析序列發(fā)現(xiàn)該基因含有一個SSR多態(tài)性位點（GCC7）。利用Primer Premier 5引物設(shè)計軟件在序列兩端設(shè)計檢測引物（表1），用成功提取的合子cDNA進行PCR擴增。擴增結(jié)果顯示，在合子cDNA中有預(yù)期的1.6 kb左右的條帶出現(xiàn)（圖2），回收測序顯示確是煙草胱硫醚-γ-合成酶基因片段。結(jié)果表明在受精后不久的煙草SR1的合子中的確有甲硫氨酸的合成。

需要特別指出的是測序發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物長度為1 677 bp，其中有一種新型序列與煙草胱硫醚-γ-合成酶基因（KJ001150）的相似度在98%，主要在SSR位點有差異。因NCBI數(shù)據(jù)庫中已存在3種煙草胱硫醚-γ-合成酶基因，故將新發(fā)現(xiàn)的基因命名為NtCGS-4，其SSR位點為（GCC3），擁有胱硫醚γ-合成酶的保守功能結(jié)構(gòu)域（圖3）。這與煙草基因組是異源四倍體，且多態(tài)性位點較為豐富的特點相符。

2.3 NtCGS-4基因5′側(cè)翼序列的克隆

按照擴增得到的NtCGS-4基因的cDNA序列設(shè)計引物，直接使用染色體步移技術(shù)來獲取NtCGS-4基因的5′側(cè)翼序列。第一輪擴增得到的延伸片段，與“2.2”中擴增得到的NtCGS-4基因的序列拼接后，設(shè)計檢測引物在基因組上進行檢測。結(jié)果證實NtCGS-4基因在圖3所示片段的基礎(chǔ)上向5′方向延伸了1 537 bp。利用本實驗室煙草基因組數(shù)據(jù)庫進行Blast比對，發(fā)現(xiàn)有一段787 bp的片段能夠與NtCGS-4基因的5′新增序列拼接成功，其中有282 bp完全重合。繼續(xù)在此基礎(chǔ)上又進行了兩輪染色體步移，分別新增NtCGS-4基因5′側(cè)翼序列161 bp和511 bp。至此將所有新增序列和“2.2”中擴增的序列拼接后分析發(fā)現(xiàn)，NtCGS-4基因的CDS的起始密碼子ATG之前共存在2 696 bp的側(cè)翼序列，包括啟動子和5′UTR。拼接序列經(jīng)基因組檢測符合預(yù)期（圖4）。

2.4 NtCGS-4蛋白理化性質(zhì)

使用在線的Protparam工具對NtCGS-4基因編碼的蛋白序列進行生物信息學(xué)分析，結(jié)果見表3。從表3可以看出，NtCGS-4蛋白由537個氨基酸組成，包含全部20種基本氨基酸類型，分子質(zhì)量57.931 2 ku，pI為6.15，屬酸性蛋白。該蛋白的正、負(fù)電荷殘基分別為47、54個，脂肪系數(shù)95.74，不穩(wěn)定性指數(shù)37.68，分析還顯示NtCGS-4蛋白的平均總疏水性為0.078。

2.5 NtCGS-4蛋白氨基酸序列的同源比對和系統(tǒng)進化分析

利用Blastx搜索煙草胱硫醚-γ-合成酶的同源序列，發(fā)現(xiàn)在番茄、馬鈴薯、歐洲油菜、水稻、玉米等農(nóng)作物以及擬南芥中都存在與之類似的蛋白序列。其中煙草本身已有3種胱硫醚-γ-合成酶基因。以煙草NtCGS-4蛋白為例，其與煙草中其他3種胱硫醚-γ-合成酶以及不同物種之間的胱硫醚-γ-合成酶的同源性都很高，氨基酸序列相似度均達到80%以上。對不同物種中胱硫醚-γ-合成酶的氨基酸序列進行比對，發(fā)現(xiàn)這些序列的C端都擁有一段極其保守的功能區(qū)段。但是在此區(qū)段以外，不同物種間的序列差別較大，說明這些區(qū)域進化速度較快。選取不同物種的胱硫醚-γ-合成酶序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)同屬茄科的番茄、馬鈴薯和煙草屬于同一分支，十字花科的歐洲油菜和擬南芥屬于同一分支，單子葉植物水稻、玉米則親緣關(guān)系較近（圖5）。值得注意的是，煙草和馬鈴薯各有-種胱硫醚-γ-合成酶與自身的其他胱硫醚-γ-合成酶親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，顯示了胱硫醚-γ-合成酶的進化途徑的多樣化。

3 小結(jié)與討論

植物中的甲硫氨酸是動物和人類重要的食物來源，但是甲硫氨酸在大多數(shù)的谷類植物中含量非常低。傳統(tǒng)的植物培育方法在提高作物甲硫氨酸水平上的作用不太明顯?，F(xiàn)在依靠轉(zhuǎn)基因技術(shù)手段在一些情況下能大幅提高作物的甲硫氨酸含量。但是轉(zhuǎn)基因植株有時也會表現(xiàn)出不正常的表型，比如生長嚴(yán)重延遲，葉子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，塊莖產(chǎn)量下降40%～60%，塊莖的顏色發(fā)生變化[11]。

植物種子發(fā)育起源于合子，合子經(jīng)過多次分裂與分化最終形成成熟胚胎，因此胚胎發(fā)育對于植物種子的正常形成十分重要。但關(guān)于甲硫氨酸在早期胚胎發(fā)生中的合成與代謝的認(rèn)識還非常有限。本研究克隆了一個在煙草合子中表達的新型胱硫醚-γ-合成酶基因，并通過染色體步移技術(shù)獲取了其5′端側(cè)翼序列。這為進一步了解甲硫氨酸在煙草早期胚胎發(fā)生中的合成與代謝機制打下基礎(chǔ)。許多農(nóng)作物的可利用部位是種子，本研究可為培育擁有高含量甲硫氨酸，且種子形態(tài)變化小的農(nóng)作物提供幫助。

參考文獻：

[1] GALILI G，AMIR R，HOEFGEN R，et al.Improving the levels of essential amino acids and sulfur metabolites in plants[J].Biol Chem，2005，386（9）：817-831.

[2] ROJE S.S-Adenosyl-L-methionine：Beyond the universal methyl group donor[J].Phytochem，2006，67（15）：1686-1698.

[3] YANG S，YIP W K，DONG J G.Mechanism and regulation of ethylene biosynthesis[J].Am Soc Plant Physiol，1990，5：112-115.

[4] MATILLA A J. Ethyelene in seed formation and germination[J]. Seed Sci Res， 2000， 6：111-126.

[5] PANG X M，ZHANG Z Y，WEN X P， et al. Polyamines，all-purpose players in response to environment stresses in plants[J]. Plant Stress， 2007，1：173-188.

[6] GIGOLASHVILI T，YATUSEVICH R，BERGER B，et al.The R2R3-MYB transcription factor HAG1/MYB28 is a regulator of methionine-derived glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis thaliana[J].Plant J，2007，51（2）：247-261.

[7] HIRAI M Y，SUGIYAMA K，TOHGE Y，et al. Omics-based identification of Arabidopsis Myb transcription factors regulating aliphatic glucosinolate biosynthesis[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（15）：6478-6483.

[8] GAKIERE B，RAVANEL S，DROUX M，et al. Mechanisms to account for maintenance of the soluble methionine pool in transgenic Arabidopsis plants expressing antisense cystathionine gamma-synthase cDNA[J].C R Acad Sci III，2000，323：841-851.

[9] KIM J，LEUSTEK T.Repression of cystathionine g-synthase in Arabidopsis thaliana produces partial methionine auxotrophy and developmental abnormalities[J].Plant Sci，2000，151：9-18.

[10] HACHAM Y，AVRAHAM T，AMIR R. The N-terminal region of Arabidopsis cystathionine gamma-synthase plays an important regulatory role in methionine metabolism[J]. Plant Physiol，2002，128（2）：454-462.

[11] DANCS G，KONDRAK M，BA′NFALVI Z.The effects of enhanced methionine synthesis on amino acid and anthocyanin content of potato tubers[J]. BMC Plant Biol，2008，8：65-75.

[12] HE Y C，SUN M X，YANG H Y.Regeneration of fertile plants from isolated tobacco zygotes by in vitro culture[J].Chin Sci Bull，2004，49（8）：810-814.