翟志芳,王 莉,鐘 華,鐘白玉,郝 飛

(第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院皮膚科,重慶400038)

短發(fā)夾狀RNA靶向抑制HaCaT細胞Hax-1基因的表達研究＊

翟志芳,王 莉,鐘 華,鐘白玉,郝 飛

(第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院皮膚科,重慶400038)

目的 觀察短發(fā)夾狀干擾RNA靶向抑制 Hax-1基因誘導(dǎo) HaCaT細胞凋亡的作用。方法 構(gòu)建特異性抑制 Hax-1的shRNA表達載體并轉(zhuǎn)染 HaCaT細胞;分別采用半定量PCR以及Western blot從mRNA和蛋白水平檢測干擾效果;流式細胞術(shù)檢測HaCaT細胞的凋亡。結(jié)果 Hax-1基因mRNA水平以及蛋白水平的表達均得到顯著抑制,HaCaT細胞凋亡率明顯升高。結(jié)論 靶向 Hax-1的shRNA顯著抑制了 Hax-1基因在 HaCaT細胞中的表達,并明顯誘導(dǎo) HaCaT細胞凋亡。

短發(fā)夾狀干擾RNA;Hax-1;HaCaT細胞;細胞凋亡

Hax-1是Suzuki等[1]于1997年首先發(fā)現(xiàn)的與 HS-1基因結(jié)合的一種蛋白。近年來,Hax-1在細胞凋亡中的調(diào)節(jié)作用引起很多學(xué)者的關(guān)注,本課題組前期的實驗研究發(fā)現(xiàn) Hax-1在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erylhemalosus,SL E)患者外周血T細胞中明顯高表達,并通過體內(nèi)外實驗證實了 Hax-1可能通過抗凋亡機制參與淋巴細胞凋亡過程,參與了SL E的發(fā)生、發(fā)展過程[2-3]。本研究擬構(gòu)建靶向 Hax-1基因的shRNA表達載體,觀察 siRNA靶向抑制 Hax-1基因表達,誘導(dǎo)HaCaT細胞凋亡的生物學(xué)效應(yīng),進一步闡明 Hax-1基因在人角質(zhì)形成細胞凋亡調(diào)節(jié)中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 質(zhì)粒pSilencer2.0-U6(Ambion公司)、脂質(zhì)體Limpofectamine2000(Invitrogen公司)、Hax-1鼠抗鼠單克隆抗體(BD biosciences公司)、HRP-GAM-IgG二抗(北京中杉公司)、Heochst33342及 PI(Sigma公司)等。

1.2 靶向 Hax-1基因shRNA表達載體的構(gòu)建

1.2.1 模板序列設(shè)計 根據(jù) GenBank中編碼 Hax-1的cDNA序列(ID BC098225),按照 shRNA設(shè)計原則,參照文獻[4],在Hax-1全長序列中選取含19個核苷酸靶序列的兩條短反向重復(fù)序列,兩端分別加上pSilencer2.0-U6對應(yīng)的Bam HⅠ及 HindⅢ酶切黏性末端以及終止識別序列,序列全長65 bp(圖1)。同時設(shè)計對照shRNA。shRNA模板由北京三博生物公司合成。

圖1 Hax-1的shRNA模板序列

1.2.2 表達載體的構(gòu)建 分別取1μL(3μg/μL)正反義表達模板,加入48μL退火緩沖液,95 ℃、2min,75 ℃、10min,緩慢冷卻至4℃。將退火形成的雙鏈定向克隆至用Bam HⅠ及HindⅢ線性化的pSilencer 2.0-U6載體中,轉(zhuǎn)化后經(jīng) EcoRⅠ和 HindⅢ酶切鑒定,最后測序鑒定。陽性克隆命名為pSilencer-Hax-1。含無關(guān)序列的陰性對照質(zhì)粒為pSilencer-none。

1.3 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 常規(guī)培養(yǎng) HaCaT細胞株至細胞達80%～90%匯合時,按Lipofectamine2000說明書進行轉(zhuǎn)染。實驗分為轉(zhuǎn)染pSilencer-Hax-1組、pSilencer-none組及未轉(zhuǎn)染組3組。轉(zhuǎn)染后的細胞經(jīng) G418篩選,陽性克隆擴增培養(yǎng)備用。

1.4 Hax-1基因mRNA表達 用 Tripure法提取總 RNA,逆轉(zhuǎn)錄后各取2μL DNA行PCR反應(yīng)β,-actin為內(nèi)參照。Hax-1特異性引物序列,F′5′ATG CGA TTC CAC GGC AAC TT 3′,R′5′CCA CTG TCC CAT CTG GCT TA 3′,擴增片斷 454 bpβ;-actin(618 bp)特異性引物序列,F′5′CGG GAC CTG ACT GAC TAC CTC 3′,R′5′CAA GAA AGG GTG TAA CGC AAC 3′。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳并采用Quantity One軟件進行半定量分析。

1.5 Western blot檢測 Hax-1蛋白表達 收集轉(zhuǎn)染后的HaCaT細胞,提取胞質(zhì)蛋白,用 Tricine-甘氨酸系統(tǒng)電泳、轉(zhuǎn)染后,3%BSA封閉,加1∶250稀釋的一抗,4℃過夜,清洗后加1∶5 000稀釋的二抗室溫下孵育2 h,清洗后,經(jīng) ECL發(fā)光試劑盒顯影,X光膠片記錄結(jié)果。用Quantity one軟件測定蛋白條帶的積分密度(IOD)。

1.6 流式細胞儀檢測 HaCaT細胞凋亡 各組取約1×105細胞制備成單細胞懸液,加入 Heochst33342,終濃度1μg/mL;37 ℃孵育10min,棄去染液,加入1 mL(5μg/mL)PI染液,4℃避光染色15min。用流式細胞儀檢測凋亡細胞陽性率。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,結(jié)果以±s表示組間比較采用χ2和t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 靶向 Hax-1基因shRNA表達質(zhì)粒的鑒定

2.1.1 酶切鑒定 結(jié)果與pSilencer2.0-U6質(zhì)粒圖譜分析一致(圖2),實驗所得陽性克隆擴增并提取質(zhì)粒后,經(jīng) EcoRⅠ、Bam HⅠ雙酶切后獲得約3.1 kb和335 bp兩條帶,經(jīng) EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切后獲得3.1 kb和400 bp兩條帶,相差的大小正好是插入片段的長度(圖3)。未插入片段的線性化pSilencer2.0-U6質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后獲得的短片段大小均為335 bp。

圖2 pSilencer2.0-U6質(zhì)粒示意圖

2.1.2 測序分析 經(jīng)酶切初步證實插入正確的質(zhì)粒進行測序,結(jié)果證明其中插入片段序列完全正確。

2.2 轉(zhuǎn)染pSilencer-Hax-1后 HaCaT細胞中 Hax-1表達變化

2.2.1 Hax-1 mRNA表達 半定量 PCR檢測結(jié)果(圖4)顯示,轉(zhuǎn)染pSilencer-none組 Hax-1 mRNA表達量與未轉(zhuǎn)染組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),轉(zhuǎn)染pSilencer-Hax-1組 Hax-1 mRNA表達量比未轉(zhuǎn)染組顯著降低(P<0.01),Hax-1 mRNA表達的抑制率達82%。

2.2.2 Hax-1蛋白表達 Western blot檢測顯示(圖5),轉(zhuǎn)染pSilencer-Hax-1組中 Hax-1蛋白的表達[(0.254 6±0.030 1)IOD]較未轉(zhuǎn)染組[(0.765 0±0.043 8)IOD]顯著降低(P<0.05),Hax-1蛋白表達的抑制率達67%;pSilencer-none組中Hax-1蛋白的表達量[(0.882 2±0.019 4)IOD]與未轉(zhuǎn)染組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 Hax-1基因shRNA表達質(zhì)粒的酶切鑒定

圖4 Hax-1 siRNA對HaCaT細胞mRNA表達的影響

圖5 Hax-1 siRNA對HaCaT細胞蛋白表達的影響

2.3 流式細胞儀檢測 HaCaT細胞凋亡 未轉(zhuǎn)染組、pSilencer-none組、轉(zhuǎn)染pSilencer-Hax-1組HaCaT細胞凋亡率分別為10.7%、9.2%、4.5%;與未轉(zhuǎn)染組相比,轉(zhuǎn)染 pSilencer-Hax-1組凋亡率減少了6.2%(P<0.05),pSilencer-none組凋亡率減少了1.5%(P>0.05)。

3 討 論

Hax-1基因相對分子質(zhì)量為35 kD、廣泛表達于多種組織及細胞中。主要分布于線粒體內(nèi)、少量分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜、可以與多種蛋白相互作用發(fā)揮不同生物學(xué)作用的蛋白質(zhì)[5-7]。已經(jīng)證實它是一種新的細胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白,具有強大的凋亡抑制作用[8-10]。Hax-1調(diào)節(jié)細胞凋亡的作用機制目前尚不明確。近年來,Mirmohammadsadegh等[11]發(fā)現(xiàn) Hax-1在銀屑病的皮損中過表達,而且在銀屑病模型中,Hax-1反義 mRNA的表達,增加了紫外線誘導(dǎo)的細胞凋亡。推測可能由于 Hax-1的表達增加,干擾表皮細胞的分化并因此促進了對末端分化的抵抗,這種抗凋亡機制是對銀屑病發(fā)病機制的一種新的理解。HaCaT細胞株源于人類表皮的角質(zhì)形成細胞,也是研究人類表皮角質(zhì)形成細胞生物學(xué)的理想模型,在銀屑病等疾病的研究中具有重要意義。

本研究采用的RNA干擾技術(shù)是一種由雙鏈RNA引發(fā)的特異性高效基因表達抑制途徑,與傳統(tǒng)的反義技術(shù)相比,RNAi能夠更高效、更特異的抑制靶基因表達,產(chǎn)生類似基因敲除的效果[12-13]。shRNA表達載體轉(zhuǎn)染的細胞經(jīng)歷穩(wěn)定、長期的mRNA抑制作用,提供了比轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的siRNA更經(jīng)濟有效的方法。本實驗選用pSilencer2.0-U6作為表達載體,成功構(gòu)建出靶向Hax-1基因的siRNA表達載體。該載體通過U6啟動子在體內(nèi)表達shRNA,shRNA在細胞中降解為類似siRNA的分子,引發(fā) RNAi過程[14-15]。本研究結(jié)果表明,pSilencer-Hax-1載體能夠有效在 HaCaT細胞中引發(fā) RNAi效應(yīng),通過下調(diào) Hax-1基因表達阻斷其介導(dǎo)的凋亡抑制作用,使HaCaT細胞凋亡率增加。該結(jié)果為進一步評價siRNA表達載體對 Hax-1基因的抑制效應(yīng)和誘導(dǎo)凋亡效應(yīng),為進一步探討Hax-1的凋亡調(diào)節(jié)作用在銀屑病等角質(zhì)形成細胞生長或功能異常相關(guān)性疾病中的作用,并開發(fā)基于RNAi的治療新策略提供了理論依據(jù)。

[1]Suzuki Y,Demoliere C,Kitamura D,et al.HAX-1,a novel intracellular protein,localized on mitochondria,directly associates with HS1,a substrate of Src family tyrosine kinases[J].J Immunol,1997,158(6):2736.

[2]翟志芳,郝飛,鐘白玉,等.HAX-1在活動期 SL E患者外周血單一核細胞中的表達及其亞細胞定位[J].中華皮膚科雜志,2008,41(1):8.

[3]翟志芳,周春麗,鐘白玉,等.HAX-1對 MRL/lpr小鼠狼瘡活動性影響的實驗研究[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2008,88(6):406.

[4]Velculescu VE,Zhang L,Vogelstein B,et al.Serial analysis of gene expression[J].Science,1995,270(5235):484.

[5]Gallagher AR,Cedzich A,Gretz N,et al.The polycystic kidney disease protein PKD2 interacts with HAX-1,a protein associated with the actin cytoskeleton[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(8):4017.

[6]Sharp TV,Wang HW,Koumi A,et al.K15 protein of Kaposi′ssarcoma-associated herpesvirus is latently expressed and binds to HAX-1,a protein with antiapoptotic function[J].J Virol,2002,76(2):802.

[7]Boyd JM,Malstrom S,Subramanian T,et al.Adenovirus E1B 19 kDa and Bcl-2 proteins interact with a common set of cellular proteins[J].Cell,1994,79(2):341.

[8]Matsuda G,Nakajima K,Kawaguchi Y,et al.Epstein-Barr virus(EBV)nuclear antigen leader protein(EBNA-LP)forms complexes with a cellular anti-apoptosis protein Bcl-2 or its EBV counterpart BHRF1 through HS1-associated protein X-1[J].Microbiol Immunol,2003,47(1):91.

[9]Yedavalli VS,Shih HM,Chiang YP,et al.Human immunodeficiency virus type 1 Vpr interacts with antiapoptotic mitochondrial protein HAX-1[J].J Virol,2005,79(21):13735.

[10]Cilenti L,Soundarapandian MM,Kyriazis GA,et al.Regulation of HAX-1 anti-apoptotic protein by Omi/HtrA2 protease during cell death[J].J Biol Chem,2004,279(48):50295.

[11]Mirmohammadsadegh A,Tartler U,Michel G,et al.HAX-1,identified by differential display reverse transcription polymerase chain reaction,is overexpressed in lesional psoriasis[J].J Invest Dermatol,2003,120(6):1045.

[12]Rye PD,Stigbrand T.Interfering with cancer:a brief outline of advances in RNA interference in oncology[J].Tumour Biol,2004,25(5-6):329.

[13]Verma NK,Dey CS.RNAOmediated gene silencing:mechanisms and its therapeutic applications[J].J Clin Pharm Ther,2004,29(5):395.

[14]Wadhwa R,Kaul SC,MiyagishiM,et al.Vectors for RNA interference[J].Curr Opin Mol Ther,2004,6(4):367.

[15]Nahreini P,Hanson AJ,Andreatta CP,et al.Altering cellular signaling pathways enhance gene silencing activity of shRNA,shRNA.ribozyme,and shRNA.antisense in neuroblastoma cells[J].Cell Mol Neurobiol,2004,24(6):781.

Study on expression of Hax-1 human keratinocyte line HaCaT by Hax-1 short hairpin RNA＊

ZHAI Zhi-fang,WANG Li,ZHONG Hua,et al.
(Department of Dermatology,Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing400038,China.)

Objective To study the function of HS1-associated protein X-1(Hax-1)shRNA in inducing apoptosis of human keratinocyte line HaCaT.Methods ShRNA expression vector pSilencer-Hax-1 was constructed.Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)technique and Western blot were used to analyze mRNA and protein expressions of Hax-1 in transfected HaCaT cells.And then apoptotic HaCaT cells were detected by flow cytometry.Results Expression of the mRNA and protein of Hax-1 was down-regulated and obvious apoptosis of HaCaT was induced.Conclusion siRNA mediated by pSilencer-Hax-1 significantly inhibited the expression of Hax-1 in HaCaT cells and obviously induced the apoptosis of HaCaT cells.

short hairpin RNA;HS1-associated protein X-1;HaCaT cells;apoptosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2010.23.021

Q522;R758.63

A

1671-8348(2010)23-3202-03

國家自然科學(xué)基金資助項目(30671886)。

2010-06-14

2010-07-20)