戴凌 田小林 譚寧 溫海濱 黃嵐珍

1.廣西桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院普通外科，廣西 桂林 541001；2.廣西桂林醫(yī)學院生物科學實驗中心，廣西 桂林 541004；3.廣西河池市人民醫(yī)院腎內(nèi)科，廣西 河池 530021

結腸癌的侵襲轉移不僅是結腸癌的基本生物學特征之一，亦是臨床上絕大多數(shù)結腸癌患者的致死因素。原發(fā)結腸癌可以進行手術切除或放射治療，但對于已經(jīng)播散轉移的結腸癌，則往往難以通過上述治療手段來獲得理想的治療效果。結腸癌的轉移與否，對結腸癌治療效果及預后具有決定性的作用，這也是結腸癌治療所面臨的主要困難與挑戰(zhàn)。究其原因，主要有兩方面：⑴惡性腫瘤的生物異質(zhì)性；⑵不同的宿主因素及體內(nèi)條件差異的存在。

細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN）首先由Ellis等［1］于1989年從人類肺癌細胞LX-1中提純，曾被命名為腫瘤細胞起源的膠原酶刺激因子（tumor cell-derived collagenase stimulatory factor，TSCF）。但后來的研究發(fā)現(xiàn)它同樣存在于人類正常組織中，由于能顯著誘導基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生，所以 Biswas等［2］于1995年將其重新命名為細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導因子。

在正常生理條件下EMMPRIN廣泛存在于人類正常組織中，如角質(zhì)細胞、胚胎上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞等多種細胞，并參與構成人類的血腦屏障，同時參與創(chuàng)傷愈合、組織修復、妊娠和胚胎發(fā)育等眾多生理過程［3］。在病理狀態(tài)如惡性腫瘤等病理過程中，EMMPRIN主要參與細胞和細胞之間或細胞和基質(zhì)之間的黏附，體外實驗發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞來源的EMMPRIN可刺激人成纖維細胞和內(nèi)皮細胞分泌產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs），從而參與破壞天然組織機械屏障，有助于癌細胞的侵襲及擴散［4-6］。

為了明確EMMPRIN在結腸癌轉移中的作用，本研究構建了EMMPRIN的真核表達載體pCMV-HA2-EMMPRIN，并將其轉染至結腸癌細胞系CT26，以觀察其對CT26細胞轉移的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株與質(zhì)粒 CT26小鼠結腸癌細胞購自中國科學院上海細胞庫，真核表達載體pCMV-HA2為本室所藏。

1.1.2 主要試劑與儀器 限制性內(nèi)切酶及T4連接酶購自Promega公司，Hyclone特級胎牛血清購自Hyclone公司，高糖型DMEM購自Gibco公司，DNA片段回收試劑盒購自Qiagen公司，質(zhì)脂體LipofectamineTM2000 Reagent購自Invitrogen公司，G418購自Gibco公司，蛋白裂解液、蛋白定量試劑盒及發(fā)光底物試劑盒均購自Pierce公司，HA單克隆抗體（鼠源性）購自Santa Cruz公司（工作濃度1∶1 000），Transwell小室（內(nèi)徑6.5 mm，孔徑8.0 μm）購自Corning公司，MatrigelTM購自Corning公司，CCK-8購自上海同仁化學有限公司，引物由英駿生物技術有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) CT26細胞用含10%胎牛血清（10% FBS）的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中不添加青霉素及鏈霉素。

1.2.2 載體構建 以登錄Genebank后獲取的EMMPRIN基因序列（NM_198591.1）為模板，應用Primer5.0引物設計軟件設計該基因的CDS區(qū)全序列的PCR上、下游引物。該引物序列中已包含內(nèi)切酶BglⅡ和EcoRⅠ序列以及必要的保護堿基、啟始及終止密碼。正向引物: 5’-CGAGATCTATGGCGGCTGCGCTGTTC-3’，反向引物: 5’-GCGAATTCTCAGGAAGAGTTCCTCTG-3’。

PCR反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物回收后，與pCMVHA2均用BglⅡ和EcoR Ⅰ（Promega）進行酶切反應。回收酶切產(chǎn)物后將二者進行連接。將連接產(chǎn)物轉化TOP10F’感受態(tài)細菌，涂板（Amp+），挑取陽性菌落擴增，提取質(zhì)粒后送英駿生物技術有限公司進行測序。

1.2.3 EMMPRIN基因過表達細胞株的建立將生長狀態(tài)良好的細胞接種在10 cm培養(yǎng)皿上，待細胞長至70%滿度時進行轉染。質(zhì)脂體LipofectamineTM2000 Reagent 10 mL（2 mg/mL）和pCMV-HA2-EMMPRIN（或空載體pCMVHA2）2 mg分別用DMEM稀釋到2 mL，二者混合后，在室溫放置30 min。用無血清DMEM洗細胞2次，將DNA和脂質(zhì)體的混合物用無血清DMEM補足到5 mL，轉染細胞6 h后，加5 mL 20% FBS的DMEM。48 h后用2 000 mg/mL的G418選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)，4 d后將G418濃度降低，14 d后將G418濃度降至200 mg/mL。待細胞克隆形成后，將平皿上的單克隆挑入96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)。之后將96孔板內(nèi)的細胞轉入24、12和6孔板培養(yǎng)。用Western blot檢測進行鑒定。

1.2.4 Western blot檢測 用細胞裂解液提取細胞蛋白（按說明書進行操作），用蛋白定量試劑盒定量（按說明書進行操作）。將蛋白樣品用10% SDS聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）進行電泳，每個蛋白樣品上樣量為10 μg，蛋白進入分離膠后用150 V恒壓電泳。用濕轉法進行轉膜。封閉液（PBST+5%脫脂奶粉）將膜于室溫封閉3 h，按工作濃度加入一抗，4 ℃封閉過夜。將膜漂洗3次后，用HRP偶聯(lián)的二抗室溫溫育1 h，而后加入化學發(fā)光試劑，用X光片曝光顯影。

1.2.5 體外侵襲實驗 Transwell小室的上室膜上鋪Matrigel，50 μg/室（用無血清DMEM稀釋），下室加入10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。將對數(shù)生長期細胞用胰酶消化后，離心后重懸于無血清DMEM培養(yǎng)基，上室內(nèi)加入5×104個細胞/室，于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的條件下培養(yǎng)。24 h后取出小室進行細胞固定，用結晶紫染色，顯微鏡下記數(shù)穿膜細胞數(shù)，每組設3個平行樣本。

1.2.6 劃痕實驗 將對數(shù)生長期細胞用胰酶消化后，離心后重懸于無血清DMEM培養(yǎng)基，種入12孔板，3×105個細胞/孔。采用10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的條件下培養(yǎng)。24 h后用200 μL槍頭在孔內(nèi)劃痕，用無血清DMEM培養(yǎng)基漂洗3次，加入2%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。實驗終止后將孔內(nèi)細胞進行固定，用結晶紫染色，顯微鏡記數(shù)并拍照。每組設3個平行樣本。

1.2.7 粘附實驗 用無血清培養(yǎng)基DMEM將Matrigel配制成0.05 μg/μL的人工基底膜膠備用。96孔板每孔中鋪Matrigel 2 μg，放于超凈臺中風干過夜。使用前每孔加入250 μL預溫的含10 g/L BSA的無血清培養(yǎng)基，于37 ℃條件下培養(yǎng)30 min，使基質(zhì)膠再水化，再吸去剩余培養(yǎng)液。消化處于對數(shù)增殖期的細胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1～2遍，用10%FBS的細胞培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度至1×106個/mL。取細胞懸液加入96孔板，接種細胞數(shù)為2×105個/孔，設3個復孔。培養(yǎng)細胞：常規(guī)培養(yǎng)1 h。細胞培養(yǎng)1 h后，將細胞懸液吸出棄去后，采用0.1%結晶紫染色，并獲取圖片；或每孔加入CCK-8混合液200 μL（CCK-8：無血清培養(yǎng)基為1∶9）繼續(xù)培養(yǎng)2 h，然后吸出CCK-8混合液100 μL在酶標儀450 nm處讀取吸光度值。

1.2.8 統(tǒng)計處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件建 立數(shù)據(jù)庫。組間差異采用t檢驗，雙側P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 真核表達載體pCMV-HA2-EMMPRIN的構建及EMMPRIN過表達細胞株的建立以Genebank登錄的EMMPRIN基因序列（NM_198591.1）為模板，應用Primer5.0引物設計軟件設計引物，通過PCR方式獲得EMMPRIN基因，長度為826 bp（圖1A）。將PCR產(chǎn)物回收后，與pCMV-HA2均用BglⅡ和EcoRⅠ（Promega）進行酶切反應?；厥彰盖挟a(chǎn)物后將二者進行連接。將連接產(chǎn)物轉化TOP10F’感受態(tài)細菌，涂板（Amp+），挑取陽性菌落擴增，提取質(zhì)粒后送英駿生物技術有限公司進行測序。將構建的真核表達載體pCMV-HA2-EMMPRIN，采用脂質(zhì)體轉染法轉染CT26細胞，經(jīng)G418篩選2周后，挑取單細胞克隆，按序進行96孔板、24孔板、6孔板培養(yǎng)。在提取細胞蛋白后，用標簽抗體（anti-HA）進行了Western blot檢測。在驗證了36個單克隆后，鑒定出過表達EMMPRIN基因的細胞株，并命名為EMMPRIN組（圖1B）。對照組為空載體pCMV-HA2轉染CT26細胞，亦經(jīng)G418篩選2周。

圖1 EMMPRIN基因的獲取及EMMPRIN過表達株的Western blot鑒定Fig.1 EMMPRIN gene was obtained through PCR and overexpression of EMMPRIN in CT26 cells was identified by Western blot

2.2 EMMPRIN促進CT26細胞的侵襲 在侵襲實驗中，對照組與EMMPRIN組均設3個平行樣本，每個樣本于10倍物鏡下觀測中心視野，共計3個視野，發(fā)生侵襲的細胞個數(shù)分別為：48.67±5.31, 103.33±8.49（圖2），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與對照組相比，EMMPRIN基因明顯促進CT26細胞的侵襲。

圖2 EMMPRIN促進CT26 cells的侵襲Fig.2 EMMPRIN promoted CT26 cells invasion(×100)

2.3 EMMPRIN促進CT26細胞的遷移 在遷移實驗中，對照組與EMMPRIN組均設3個平行樣本，每個樣本于10倍物鏡下觀測2個視野，共計6個視野，遷移的細胞個數(shù)分別為：18.33±2.05和40.67±2.49（圖3），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與對照組相比，EMMPRIN基因能明顯促進CT26細胞的遷移。

2.4 EMMPRIN抑制CT26細胞的粘附 在粘附實驗中，EMMPRIN組與對照組均設3個平行樣本，每個樣本于10倍物鏡下觀測中心視野，共計3個視野（圖3），CCK-8吸光度的數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果分別為：2.10±0.22和3.33±0.17（圖4），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與對照組相比，EMMPRIN基因能明顯抑制CT26細胞的粘附。

圖3 EMMPRIN促進CT26的遷移Fig.3 EMMPRIN promoted CT26 migration(×100)

圖4 EMMPRIN抑制CT26的粘附Fig.4 EMMPRIN inhibited CT26 cells adhesion(×200)

3 討 論

Davidson等［7］對卵巢癌的研究及Tsai等［8］對胰腺癌的研究均顯示，EMMPRIN與卵巢癌及胰腺癌預后的密切相關。同時在對肝癌的研究發(fā)現(xiàn)，EMMPRIN在正常肝臟組織中均為陰性表達，而肝癌組織中的陽性率達100%，并且與肝癌的轉移和臨床分析相關［9］。在其他腫瘤中，EMMPRIN表達與大腸癌、胃癌的病理類型、轉移方式相關，在未分化癌中顯著高表達，伴血行和淋巴轉移者亦呈高表達。EMMPRIN表達與非小細胞肺癌的淋巴結轉移和病理分期明顯相關。另外，在霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、口腔癌等惡性腫瘤中都發(fā)現(xiàn)EMMPRIN的表達明顯增強。大量的臨床和病理研究表明，EMMPRIN在惡性腫瘤的生長、浸潤、轉移和誘導腫瘤組織的惡性轉化等方面起重要作用，并與惡性腫瘤的病理類型和預后密切相關，可以作為判斷腫瘤預后的重要指標［10-11］。

在本實驗中，本研究構建包含EMMPRIN基因編碼框的真核表達載體pCMV-HA2-EMMPRIN，通過質(zhì)脂體轉染CT26細胞，經(jīng)G418篩選，建立穩(wěn)定表達EMMPRIN基因的CT26細胞株。

Marieb等［12］轉染增加EMMPRIN在低侵襲性的乳腺癌細胞系MDA-MB-436細胞的表達，可以促進該乳腺癌細胞的非錨地依賴性生長（anchorage-independent growth）和透明質(zhì)酸的形成，同時增加腫瘤細胞的侵襲能力。

目前，EMMPRIN在腫瘤侵襲、轉移中的作用機制還不明確，研究表明可能與以下機制有關。體外實驗發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞來源的EMMPRIN通過激活磷脂酶A2、5-脂氧合酶和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）p38激酶信號通路刺激人成纖維細胞和內(nèi)皮細胞分泌產(chǎn)生MMPs［13-14］；在EMMPRIN刺激多種MMPs生成的同時，對于MMPs組織抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP）TIMP-1和TIMP-2卻無作用［15］，導致使MMPs/TIMPs比值增加。EMMPRIN通過促進MMPs的生成使其含量的增加，從而使MMPs/TIMPs的比值上升，導致腫瘤組織中細胞外基質(zhì)生成與降解的平衡被打破，使細胞外基質(zhì)降解增加，從而促進腫瘤的侵襲。本研究通過體外侵襲實驗、遷移實驗、粘附實驗發(fā)現(xiàn)EMMPRIN基因可明顯促進小鼠結腸癌細胞CT26的侵襲與遷移，并抑制其粘附，提示EMMPRIN基因?qū)T26細胞轉移潛能的具有增強作用。

除上述經(jīng)典作用機制外，Tang等［16］通過共培養(yǎng)EMMPRIN表達陽性的腫瘤細胞和纖維母細胞，在模擬腫瘤-基質(zhì)相互作用的模型中發(fā)現(xiàn)，EMMPRIN通過刺激MMPs的產(chǎn)生促使腫瘤局部微環(huán)境中MMPs活性升高，導致細胞膜表面的膜相聯(lián)的EMMPRIN蛋白裂解增加釋放出可溶性的EMMPRIN蛋白。這些可溶性的EMMPRIN蛋白又通過旁分泌的途徑進一步促進臨近腫瘤的成纖維細胞產(chǎn)生MMPs和EMMPRIN，形成正反饋的調(diào)節(jié)機制，促進腫瘤的生長、轉移和血管形成。Sidhu等［17］研究亦發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞周圍的具有功能活性的EMMPRIN蛋白主要是腫瘤細胞通過微泡釋放作用產(chǎn)生的。含有EMMPRIN蛋白的微泡由腫瘤細胞釋放后，迅速裂解為具有功能活性的EMMPRIN蛋白，刺激腫瘤周圍的成纖維細胞產(chǎn)生MMPs促進腫瘤的生長和轉移。

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