熊娟 徐笑紅 陳文虎 李一榮 胡麗華

1. 浙江省腫瘤醫(yī)院檢驗科，浙江 杭州 310022；2. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗科，湖北 武漢 430022

表柔比星是治療乳腺癌的常見化療藥物，但近年來其療效不佳是困擾臨床應(yīng)用的一大問題，目前配合基因治療提高表柔比星的療效，是乳腺癌治療發(fā)展的新趨勢。p21（cyclin-dependent kinase interacting protein 1, p21WAF1/CIP1）基因是目前備受關(guān)注的一種腫瘤抑制基因，同時又是一種重要的細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子，在細(xì)胞的生理、病理增殖與分化過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，有研究顯示p21的低表達(dá)預(yù)示腫瘤的進(jìn)展和高度惡性傾向［1］。此時若恢復(fù)其與細(xì)胞周期解偶聯(lián)的調(diào)控機(jī)制及正常的基因表達(dá)，這對于處于增殖旺盛期的腫瘤細(xì)胞而言具有重大意義［2］。本研究即采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)高表達(dá)p21基因，以研究其對表柔比星作用于乳腺癌細(xì)胞的敏感性影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和試劑 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫，采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液（Gibco公司），置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。表柔比星購自Sigma公司，溶解于無菌的0.9%的NaCl溶液中，配成2 mg/mL的儲存液，使用前稀釋成終濃度為0.2 μg/mL的工作液。pEGFP-C2空質(zhì)粒由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所惠贈。LipofectamineTM2000、TRIzol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品；G418為Gibco公司產(chǎn)品；質(zhì)粒抽提試劑盒為美國Omega公司產(chǎn)品；MTT及DMSO，碘化丙啶（propidium iodide，PI）購自Sigma公司；ReverTra Ace-a-反轉(zhuǎn)錄試劑為日本Toyobo公司產(chǎn)品；SYBR Green Ⅰ染料購自上海申友公司。

1.2 方法

1.2.1 基因轉(zhuǎn)染及細(xì)胞篩選 以質(zhì)粒pcDNA3-p21為模板，定向引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點，PCR擴(kuò)增獲得全長p21基因；隨即將p21基因插入到經(jīng)同樣酶切處理的pEGFP-C2質(zhì)粒中，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化和篩選構(gòu)建獲得帶有增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent proteins，EGFP）真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-p21。pEGFP-p21經(jīng)酶切和測序鑒定后，即可用于轉(zhuǎn)染實驗。按轉(zhuǎn)染說明書的要求，分別將pEGFP-p21和pEGFP-C2轉(zhuǎn)染至MCF-7細(xì)胞，48 h后換用含G418的DMEM完全培養(yǎng)液進(jìn)行篩選，熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達(dá)及定位，挑取表達(dá)EGFP同時具有G418抗性的克隆，傳代擴(kuò)大培養(yǎng)，建立穩(wěn)定表達(dá)p21基因的細(xì)胞株，將篩選獲得的細(xì)胞株分別命名為MCF-7-p21和MCF-7-pEGFP。提取以上2組細(xì)胞的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA待用。

1.2.2 表柔比星對p21基因轉(zhuǎn)染前后MCF-7細(xì)胞增殖抑制狀況的影響 實驗共分4組：未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞組（空白對照組）、0.2 μg/mL表柔比星處理MCF-7細(xì)胞組（單獨加藥組）、pEGFP-p21轉(zhuǎn)染組（MCF-7-p21組）和0.2 μg/mL表柔比星處理MCF-7-p21細(xì)胞組（聯(lián)合組），每組設(shè)6個復(fù)孔。單獨加藥組與聯(lián)合組在細(xì)胞鋪板培養(yǎng)8 h后，于每孔中加入0.2 μg/mL表柔比星，實驗終止前每孔加入MTT 20 μL，4 h后棄去培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，待結(jié)晶溶解后在酶標(biāo)儀上570 nm波長處測定的吸光度值（A），實驗重復(fù)3次。計算每組細(xì)胞的增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-A實驗組平均值/A空白對照組平均值)×100%，繪制生長抑制曲線圖。同時應(yīng)用公式計算p21基因轉(zhuǎn)染與表柔比星聯(lián)合作用的增敏效果：Q=E聯(lián)合組/［E單獨加藥組+(1-E單獨加藥組)×Ep21轉(zhuǎn)染組］，其中E代表增殖抑制率，Q<0.85表示兩者相互拮抗，0.85≤Q≤1.15表示兩者作用相加，Q>1.15表示兩者具有協(xié)同作用。

1.2.3 細(xì)胞周期的檢測 收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞（1×106個細(xì)胞/組），PBS洗滌細(xì)胞2次，離心后回收細(xì)胞，用預(yù)冷的70%乙醇溶液在-20 ℃條件下固定細(xì)胞過夜，用含核糖核酸酶A（RnaseA） 的PI染色，4 ℃避光60 min后行流式細(xì)胞儀檢測，CellQuest軟件分析處理。

1.2.4 凋亡率的檢測 收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞（1×106個細(xì)胞/組）接種于6孔培養(yǎng)板，24 h后用70%冰乙醇固定細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞，加入5 μg/mL的Hoechst 33342染液1 mL反應(yīng)15 min，再加入100 μg/mL的PI 染液0.5 mL，-20 ℃避光靜置10 min后，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，并計數(shù)細(xì)胞凋亡、壞死百分率。評判標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核染為淡蘭色為Hoechst 33342染色(-)，細(xì)胞核濃染為亮蘭色或顆粒狀為Hoechst 33342染色(+)；細(xì)胞核被PI 拒染為PI 染色(-)，細(xì)胞核染為紅色為PI 染色(+)。因此，Hoechst 33342 (-)/ PI(-)為活細(xì)胞；Hoechst 33342 (+)/ PI(-)為凋亡細(xì)胞；PI(+)為壞死細(xì)胞。同一處理隨機(jī)選擇6個觀察視野，計數(shù)至少500個細(xì)胞，計算凋亡率。

1.2.5 實時熒光定量PCR法（real-time fluorogent quantitative PCR，RFQ-PCR）檢測p21和survivin mRNA的表達(dá) 收集各組上述不同方法處理的細(xì)胞，每組1×106個細(xì)胞/mL，用TRIzol試劑提取總RNA，紫外分光光度儀定量后各取2 μg RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA備用，具體步驟參照ReverTra Ace-a-反轉(zhuǎn)錄試劑說明書。隨后進(jìn)一步檢測p21和survivin在細(xì)胞中的表達(dá)量，p21基因上游引物5’-CAGGGGACAGCAGAGGAAGA-3’，下游引物5’-TTAGGGCTT CCTCTTGGAGAA-3’；survivin基因上游引物5’-AGAACTGGCCCTTCTTGGAGG-3’，下游引物5’-CTTTTTATGTTCCTCTATGGGGTC-3’；以GAPDH為內(nèi)參照，GAPDH上游引物5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游引物5’-GAAGATGGTGATGGGATTC-3’。利用SYBR Green Ⅰ染料在LightCycle定量PCR儀上檢測各擴(kuò)增反應(yīng)的情況，擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共40個循環(huán)，分別進(jìn)行熒光檢測，并制作熔解曲線對PCR產(chǎn)物的特異性進(jìn)行鑒定，此過程中可密切觀察不同產(chǎn)物的熔解情況，最后反應(yīng)冷卻至40 ℃。該檢測獨立重復(fù)3次。由于各CT值與該模板中目的基因含量的對數(shù)值存在線性關(guān)系，目的基因含量越多，CT值越小，本研究根據(jù)公式得出目的基因的相對值：目的基因＝2-ΔΔCT，其中ΔΔCT=ΔCT標(biāo)本-ΔCT校正組=(CT標(biāo)本目的基因-CTGAPDH)-(CT校正組目的基因-CTGAPDH)。本研究中，均以未經(jīng)任何處理的HepG2細(xì)胞（即空白對照組）作為校正組。

1.3 統(tǒng)計處理 以上實驗均獨立重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以表示。組間比較采用單因素分析及t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 p21基因轉(zhuǎn)染后的鑒定及細(xì)胞定位 利用LipofectaminTM2000與G418對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染和篩選后，得到高表達(dá)p21的MCF-7細(xì)胞株，RFQPCR亦證實，pEGFP-p21轉(zhuǎn)染組、pEGFP-C2轉(zhuǎn)染對照組和空白對照組中p21 mRNA的表達(dá)水平（用2-ΔΔct值得到目的基因的表達(dá)量）分別為：155.12±56.00、2.06±0.55和1.00±0.00，結(jié)果提示，pEGFP-p21轉(zhuǎn)染組的p21 mRNA的表達(dá)量與對照組比較，差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義（F=22.56，P<0.01）。其中與空白對照組比較，pEGFP-p21轉(zhuǎn)染組p21 mRNA的表達(dá)水平是其155倍（t=4.77，P<0.05），而pEGFP-C2轉(zhuǎn)染組與空白對照組間，經(jīng)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.35，P>0.05），結(jié)果說明p21基因轉(zhuǎn)染成功。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)pEGFP-C2轉(zhuǎn)染組中，細(xì)胞內(nèi)綠色熒光主要分布于細(xì)胞質(zhì)中（圖1A）；而p21轉(zhuǎn)染組，綠色熒光主要集中在細(xì)胞核內(nèi)，表達(dá)強時可凝聚成團(tuán)塊表達(dá)于核仁（圖1B）。48 h后，將瞬轉(zhuǎn)成功的p21轉(zhuǎn)染組細(xì)胞給與含有G418培養(yǎng)液進(jìn)行篩選，擴(kuò)大培養(yǎng)得到穩(wěn)定高表達(dá)p21基因的MCF-7細(xì)胞，鏡下呈攜帶綠色熒光的細(xì)胞克隆團(tuán)生長（圖1C）。

2.2 表柔比星聯(lián)合p21基因轉(zhuǎn)染對MCF-7細(xì)胞增殖的影響 MTT法檢測結(jié)果顯示，0.2 μg/mL的表柔比星單用及聯(lián)合p21基因后，對MCF-7細(xì)胞均具有一定抑制作用（圖2）。與表柔比星單獨處理組相比，聯(lián)合組比表柔比星單獨處理組對MCF-7細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)要提早2 d（P<0.05）；在藥物處理第3、4天，聯(lián)合組的抑制效應(yīng)明顯增強，顯著大于表柔比星單獨加藥組（P<0.01）。表柔比星與p21基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合用時，p21可促進(jìn)表柔比星對MCF-7細(xì)胞的殺傷作用，且抑制效應(yīng)隨作用時間的增加而增強（r=0.91，P<0.05），兩者聯(lián)用呈效應(yīng)的相加作用，計算得出聯(lián)合作用效果Q值=1.07。

圖2 表柔比星聯(lián)合p21轉(zhuǎn)染對MCF-7細(xì)胞增殖能力的影響Fig.2 Inhibitory effects of epirubicin combined with p21 gene transfection on proliferation of MCF-7 cells detected by MTT assay

2.3 細(xì)胞周期變化 由表1可見，與MCF-7和MCF-7-pEGFP細(xì)胞比較，MCF-7-p21細(xì)胞中處于G0/G1期和S期的細(xì)胞比例明顯增加，而G2/M期的細(xì)胞比例明顯減少。

2.4 細(xì)胞凋亡情況 由圖3所示，與兩對照組相比，PI和Hoechst33342 熒光染色未見p21基因轉(zhuǎn)染對MCF-7細(xì)胞有顯著性形態(tài)學(xué)影響，細(xì)胞核呈彌散均勻熒光，也無明顯地細(xì)胞死亡，凋亡率改變差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表1 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞細(xì)胞周期的變化Tab.1 Cell cycle phase patterns of MCF-7 after transfection[( )%]

表1 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞細(xì)胞周期的變化Tab.1 Cell cycle phase patterns of MCF-7 after transfection[( )%]

*: P＜0.05, compared with MCF-7 group and MCF-7-pEGFP group.

2.5 單獨用藥與聯(lián)合作用后survivin mRNA的水平變化 根據(jù)實時熒光定量PCR的2-DDCT分析結(jié)果顯示［3］，24 h時空白對照組、單獨加藥組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對照組、p21轉(zhuǎn)染組、聯(lián)合組的survivin mRNA水平分別為1.00±0.00、0.22±0.08、1.01±0.19、0.56±0.10和0.13±0.05；48 h時各組的survivin mRNA水平分別為1.00±0.00、0.21±0.05、1.05±0.05、0.17±0.04和0.03±0.00。與空白對照組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對照組比較，單獨加藥組、p21轉(zhuǎn)染組、聯(lián)合組的survivin的表達(dá)水平較空白對照組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對照組相比明顯下調(diào)（P均<0.01）。在24 h時，聯(lián)合組的survivin mRNA水平低于單獨加藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；在48 h時，聯(lián)合組中survivin的表達(dá)明顯受到了抑制，與單獨加藥組相比，差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01，圖4）。

圖3 Hoechst33342/PI染色對轉(zhuǎn)染后MCF-7細(xì)胞的形態(tài)學(xué)比較Fig.3 Morphology of the MCF-7 cells stained with Hoechst33342/PI after transfection(×400)

圖4 RFQ-PCR法檢測各組MCF-7細(xì)胞中survivin mRNA相對表達(dá)的情況Fig.4 Expression of survivin mRNA in MCF-7 cells after different treatments detected by RFQ-PCR

3 討 論

乳腺癌是我國常見婦科腫瘤，臨床發(fā)現(xiàn)時許多已發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，有研究證實，合理劑量表柔比星的運用以及手術(shù)切除的成功與患者預(yù)后密切相關(guān)［4］。但隨著耐藥性的逐年升高，如何提高其療效是臨床治療中亟待解決的問題。目前乳腺癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，但一般認(rèn)為是細(xì)胞周期失控性疾病，大部分乳腺細(xì)胞經(jīng)歷了G1期或G2期控制點的缺陷，并能利用受損傷或未完全復(fù)制的DNA來啟動有絲分裂，導(dǎo)致組織異常的持續(xù)增生，這提示細(xì)胞繞過細(xì)胞周期阻滯途徑是其永生化及癌變的必要條件［5］。作為廣泛的細(xì)胞周期素依賴性激酶（cyclin/CDK）的抑制蛋白，p21能參與細(xì)胞生長抑制、分化、衰老及DNA損傷修復(fù)等功能的調(diào)節(jié)，而且參與介導(dǎo)許多轉(zhuǎn)錄因子功能的發(fā)揮，這使其在細(xì)胞周期、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中處于重要的位置［6］。

survivin是細(xì)胞凋亡抑制因子（inhibitor of apoptosis family of proteins，IAPs）家族中最強的凋亡抑制因子，近年來在乳腺癌的相關(guān)研究領(lǐng)域中，許多研究提示survivin的表達(dá)可作為乳腺癌患者獨立的預(yù)后因子［7-8］。臨床上survivin表達(dá)水平高的腫瘤患者存活率低，也易產(chǎn)生化療耐藥及預(yù)后不佳等問題［9］，這提示survivin極可能起乳腺癌惡性轉(zhuǎn)化和耐藥基因的角色。

為了研究p21基因和表柔比星的聯(lián)合效應(yīng)，本課題組將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染p21基因后的MCF-7-p21細(xì)胞與0.2 μg/mL表柔比星共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)p21能明顯促進(jìn)表柔比星對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用，這顯示p21可能通過某種途徑增強了表柔比星的療效。為進(jìn)一步了解該作用機(jī)制，本研究利用PI和Hoechst33342雙標(biāo)染色法對轉(zhuǎn)染后的MCF-7細(xì)胞進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)p21轉(zhuǎn)染對MCF-7細(xì)胞凋亡率的改變并不顯著，多數(shù)細(xì)胞核呈彌散均勻的蘭色熒光，也無明顯的細(xì)胞死亡。但通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)p21轉(zhuǎn)染后，MCF-7細(xì)胞的生長受到了明顯抑制，G1期的細(xì)胞比例明顯增加，G2期和S期比例下調(diào)，這與耐藥基因survivin表達(dá)受到抑制時，對應(yīng)的細(xì)胞周期時相是一致的［10］。survivin mRNA的水平在細(xì)胞周期的G1期時難以檢測到，S期時開始增加，G2/M期出現(xiàn)異常高的特異表達(dá)。且survivin的近5’端含有3個細(xì)胞周期依賴性元素CDE（GGCGG at -6、-12和-171）和1個細(xì)胞周期同源序列CHR（ATTTGAA at -42），CDE/CHR作為細(xì)胞周期G1期的阻滯元件，使survivin可能同G1/S期的阻滯產(chǎn)生聯(lián)系。故本研究推測，p21的高表達(dá)可能會下調(diào)MCF-7細(xì)胞中survivin的表達(dá)，進(jìn)而增強乳腺癌細(xì)胞對表柔比星的敏感性，緩解其抑癌效益不佳的情況。

目前在對survivin啟動子區(qū)分析時，Hoffman等［10］發(fā)現(xiàn)survivin轉(zhuǎn)錄抑制可能是通過野生型p53與下游靶分子間的相互作用來實現(xiàn)的。而p21蛋白是p53下游靶分子中最重要的一個抑癌基因，p53許多生物學(xué)功能的發(fā)揮都需在p21協(xié)助下完成的［11］。本研究通過RFQPCR發(fā)現(xiàn)，p21轉(zhuǎn)染和表柔比星聯(lián)合作用MCF-7細(xì)胞后，細(xì)胞中的survivin mRNA水平低于單獨加藥組，且隨聯(lián)合作用時間的延長，p21基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞內(nèi)survivin表達(dá)的抑制效應(yīng)明顯增強。

綜上所述，筆者認(rèn)為腫瘤耐藥是化療中常見的難題之一，這一問題的解決必將提高腫瘤患者治療效果，對延長患者的生存期有重大影響。

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