陳蜜 徐向英 許德權(quán) 趙芳宗 許慶勇 胡松柳 徐建宇

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科，黑龍江 哈爾濱 150081

*：現(xiàn)工作單位，浙江省寧波市鄞州人民醫(yī)院腫瘤放化療中心，浙江 寧波 315000

肺癌是我國常見的惡性腫瘤，放射治療是其主要的治療手段之一。Bcl-2基因是一種重要的抑制細(xì)胞凋亡的基因，廣泛存在于各種腫瘤細(xì)胞中。Bcl-2基因的高表達(dá)影響著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并使腫瘤細(xì)胞對(duì)放療和化療產(chǎn)生抵抗［1］。有證據(jù)表明，Bcl-2基因的高表達(dá)會(huì)抑制放、化療誘導(dǎo)的凋亡，而抑制Bcl-2基因的表達(dá)可能會(huì)增加放、化療的敏感性［2-3］。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是雙鏈小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）引起特異性靶mRNA裂解而抑制其表達(dá)的過程，體內(nèi)、外的研究顯示了RNAi在癌癥基因治療方面良好的應(yīng)用前景［4-6］。本實(shí)驗(yàn)利用抑制Bcl-2基因表達(dá)的短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染至非小細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞中，以觀察特異性抑制Bcl-2基因表達(dá)對(duì)NCI-H460的細(xì)胞凋亡及放射敏感性的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株及質(zhì)粒 非小細(xì)胞肺癌NCIH460細(xì)胞株由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)遺傳教研室提供。以pCYU6/GFP/Neo為載體的Bcl-2/shRNA重組質(zhì)粒購自上海Chooseasy公司，針對(duì)Bcl-2基因的shRNA特異序列Bcl-2/shRNA：5’-GGTGAAGTCAACATGCCTGCTTCAAGAGAGCAGGCATGTTGACTTCAC-3’；無義序列Neg-shRNA：5’-GTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATT-3’。

1.1.2 主要試劑及儀器 脂質(zhì)體LipofectamineTM2000和G418購自美國invitrogen公司，小鼠抗人Bcl-2、β-actin單克隆抗體系SantaCruz公司產(chǎn)品，馬抗小鼠堿性磷酸酶標(biāo)記二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清為杭州四季青產(chǎn)品，直線加速器為美國Varian 2100C/D。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 NCI-H460細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%溫箱中培養(yǎng)至指數(shù)生長期，常規(guī)接種于6孔板，每孔密度為4.0×105個(gè)細(xì)胞，24 h后約80%～90%匯合時(shí)，按照LipofectamineTM2000說明書操作將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至NCI-H460細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后24 h傳代，48 h后加入400 μg/mL的G418，篩選陽性克隆，兩周后改為200 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)至肉眼可見克隆。熒光顯微鏡下標(biāo)記含綠色熒光蛋白的克隆，將其挑出后置于培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞照射 采用直線加速器產(chǎn)生的6MV-X射線室溫照射細(xì)胞，劑量率為4 Gy/min，照射時(shí)將培養(yǎng)瓶的細(xì)胞面朝上，并覆1 cm厚的補(bǔ)償物，源皮距為100 cm。

1.2.3 Western blot檢測(cè)Bcl-2蛋白表達(dá)水平分別收集轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，以考馬斯亮藍(lán)G-250染料法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。蛋白上樣量為60 μg，12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5 h，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，用1% BSA 4 ℃封閉過夜，分別加入小鼠抗Bcl-2和β-actin單抗后溫育2 h TBST漂洗，加馬抗小鼠堿磷酶標(biāo)記二抗后溫育1 h，TBST及TBS漂洗，將NC膜浸于1 mL顯色液中避光約10 min后觀察結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Hoechst 33258染色法觀察細(xì)胞凋亡 將轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞各分為兩組，一組接受直線加速器4 Gy的X線照射，照射后培養(yǎng)48 h；另一組未接受X線照射作為對(duì)照組。去除培養(yǎng)液，加入0.5 mL固定液固定10 min后，以PBS清洗細(xì)胞2次，每次3 min。避光條件下加入0.5 mL Hoechst 33258后用搖床均勻晃動(dòng)，染色5 min，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。每個(gè)標(biāo)本在高倍鏡下用數(shù)碼成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，攝取相鄰不重疊的4個(gè)視野，由經(jīng)驗(yàn)資深實(shí)驗(yàn)技師閱片，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液后，以不同數(shù)量的細(xì)胞分別接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h后，按由低到高的細(xì)胞密度分別接受0、2、4、6、8 Gy的X線照射，每組細(xì)胞的每個(gè)照射劑量點(diǎn)設(shè)3個(gè)復(fù)瓶。照射后繼續(xù)培養(yǎng)14 d，用無水乙醇固定，結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)≥50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用多靶單擊模型SF=1-（1-eD/Do）N繪制細(xì)胞存活曲線，并根據(jù)曲線計(jì)算D0、Dq、N和SF2值。

1.3 統(tǒng)計(jì)處理 用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料采用表示，多組均數(shù)的比較采用方差分析，組間比較用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Bcl-2/shRNA重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染結(jié)果NCI-H460細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，篩選獲得陽性克隆，熒光顯微鏡下可見成克隆的發(fā)綠色熒光的NCI-H460轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，細(xì)胞呈多邊形證明轉(zhuǎn)染成功（圖1）。

圖1 轉(zhuǎn)染Bcl-2/shRNA重組質(zhì)粒前后NCI-H460細(xì)胞的比較Fig.1 Comparison of NCI-H460 cells untransfected and transfected with Bcl-2/shRNA

2.2 Western blot檢測(cè)Bcl-2蛋白表達(dá)水平變化 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示H460、H460-Neg及H460-RNAi細(xì)胞的Bcl-2/β-actin蛋白表達(dá)水平分別為0.922±0.004、0.914±0.011和0.329±0.007。前兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.09，P=0.32），而H460-RNAi細(xì)胞與其余兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=88.54，P<0.05；t=87.45，P<0. 05）。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示Bcl-2/shRNA重組質(zhì)粒能顯著抑制Bcl-2基因的蛋白表達(dá)水平，而Neg-shRNA質(zhì)粒無明顯的抑制作用（圖2）。

2.3 細(xì)胞凋亡率變化情況 將Hoechst 33258染色后的細(xì)胞放置在熒光顯微鏡下觀察，正常細(xì)胞核為圓形，呈淡藍(lán)色；凋亡細(xì)胞的核由于染色質(zhì)濃集而呈現(xiàn)亮藍(lán)色，核呈分葉、碎片狀等（圖3）。X射線照射前，H460細(xì)胞的凋亡率為（2.3±0.7）%，與H460細(xì)胞組及H460-Neg細(xì)胞組比較明顯增加（t=-17.99，P<0.05；t=-14.87，P<0.05）。X射線照射48 h后，H460-RNAi細(xì)胞的凋亡率高達(dá)（24.9±1.4）%，與其余兩組細(xì)胞照射后相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-26.70，P<0.05；t=-24.95，P<0.05）；同時(shí)與未照射的H460-RNAi細(xì)胞相比，凋亡率也有明顯升高（t=-17.85，P<0.05）。結(jié)果表明，干擾質(zhì)粒Bcl-2/shRNA能夠促進(jìn)NCI-H460細(xì)胞凋亡，同時(shí)提高細(xì)胞對(duì)X射線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（表1）。

圖2 Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平Fig.2 Effect of Bcl-2 shRNA on Bcl-2 protein levels in NCI-H460 cells by Western blot

圖3 熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化Fig.3 Cell apoptosis of stable transfection with Bcl-2 shRNA by morphological observation

表1 4 Gy X射線照射前后的凋亡率比較Tab.1 Apoptosis rates at the dose of 4 Gy X-ray and without radiation[( )%]

表1 4 Gy X射線照射前后的凋亡率比較Tab.1 Apoptosis rates at the dose of 4 Gy X-ray and without radiation[( )%]

2.4 細(xì)胞克隆形成分析 根據(jù)多靶單擊數(shù)學(xué)模型所擬合的細(xì)胞存活曲線顯示H460-RNAi細(xì)胞較其余兩組明顯左移（圖4）。而所得的細(xì)胞存活參數(shù)D0、Dq、N和SF2值H460細(xì)胞組分別為1.39、1.39、2.72、0.52；H460-Neg細(xì)胞組分別為1.21、1.28、2.87、0.46；H460-RNAi細(xì)胞組分別為0.97、0.75、2.18、0.26。可見H460-RNAi細(xì)胞組的所有細(xì)胞存活參數(shù)均低于其余兩組，特別是D0、Dq值，而H460細(xì)胞組與H460-Neg細(xì)胞組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組比較，提示H460-RNAi細(xì)胞對(duì)射線的抵抗能力低及細(xì)胞的亞致死損傷修復(fù)能力弱，即放射敏感性顯著增高。

圖4 不同細(xì)胞存活曲線Fig.4 Survival curves of different cells

3 討 論

放射治療是肺癌的主要治療手段之一，但療效仍不盡人意。影響肺癌放射治療療效的因素很多，如腫瘤的大小、乏氧細(xì)胞的多少、腫瘤細(xì)胞固有的放射敏感性等，其中腫瘤細(xì)胞固有的放射敏感性是最重要的因素，而放射敏感性是指腫瘤對(duì)射線不同程度的反應(yīng)。影響腫瘤細(xì)胞固有放射敏感性的因素很多，凋亡是其中之一［7］。Bcl-2蛋白是Bcl家族中一種重要的抑制細(xì)胞凋亡蛋白，能通過線粒體凋亡途徑抑制細(xì)胞色素C從線粒體中釋放而抑制凋亡。研究表明，Bcl-2的高表達(dá)會(huì)抑制放療誘導(dǎo)的凋亡，而抑制Bcl-2的表達(dá)可能會(huì)增加放射敏感性［2］。最早研究的Bcl-2反義寡核苷酸已經(jīng)多次成功的應(yīng)用于臨床前及臨床研究中，但反義寡核苷酸很容易降解，只能起一過性的瞬時(shí)作用，而RNAi技術(shù)可以克服這一缺點(diǎn)。RNAi是指在生物體細(xì)胞內(nèi)外源性或內(nèi)源性的雙鏈RNA誘發(fā)的同源mRNA高效特異性降解所引起的序列特異性基因沉默現(xiàn)象。RNAi技術(shù)具有高效率、可以向子代遺傳等優(yōu)點(diǎn)，還可同時(shí)針對(duì)多個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行研究［8］。

之前已有報(bào)道非小細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞株的Bcl-2含量較高［9-10］，且細(xì)胞株比較適合轉(zhuǎn)染。本研究旨在觀察利用shRNA重組干擾質(zhì)粒抑制NCI-H460細(xì)胞內(nèi)的Bcl-2表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞凋亡及放射敏感性的影響。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示與H460細(xì)胞和H460-Neg細(xì)胞比較，H460-RNAi細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，說明Bcl-2/shRNA重組干擾質(zhì)粒能有效的抑制NCI-H460細(xì)胞內(nèi)的Bcl-2基因表達(dá)。

國外有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)細(xì)胞群體中，照射后以凋亡形式死亡的細(xì)胞所占比例越大，其放射敏感性越高，這是衡量放射敏感性的重要指標(biāo)。Tanaka等［11］也報(bào)道稱腫瘤細(xì)胞對(duì)射線的敏感性與放射導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞的凋亡有關(guān)。本研究通過形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)顯示，照射前H460-RNAi細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯增加，說明抑制Bcl-2基因表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡；而照射后H460-RNAi細(xì)胞的凋亡率明顯高于照射后的對(duì)照組及未放療組，由此可以看出特異性抑制NCI-H460細(xì)胞的Bcl-2基因表達(dá)可以協(xié)同增加射線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)NCI-H460細(xì)胞的放射敏感性。以上觀點(diǎn)同Anai等［12］及Nguyen等［13］的研究一致。

細(xì)胞存活曲線是放射生物學(xué)的一個(gè)重要參數(shù)，D0為平均致死量，同一種細(xì)胞D0值的改變標(biāo)志著細(xì)胞放射敏感性的變化，D0值越小則說明細(xì)胞對(duì)射線的抵抗能力越低；而Dq反映肩區(qū)大小，表示細(xì)胞亞致死損傷修復(fù)能力的大小，Dq值越小，表明細(xì)胞對(duì)亞致死損傷修復(fù)能力越弱。N為外推數(shù)和靶數(shù)，反應(yīng)肩區(qū)大小，N值越小則預(yù)示對(duì)放射線越敏感。SF2為細(xì)胞受到2 Gy照射后的存活分?jǐn)?shù)，SF2值越小則放射抗拒性越低。本研究中的細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)表明：H460-RNAi細(xì)胞組的D0、Dq、N和SF2值分別為0.97、0.75、2.18和0.26，均小于其余兩組細(xì)胞，特別是D0、Dq值，提示轉(zhuǎn)染Bcl-2/shRNA重組質(zhì)粒后細(xì)胞放射抵抗性明顯降低，能更有效地抑制NCI-H460細(xì)胞亞致死性損傷修復(fù)，這也可能是其放射增敏作用的原因之一，國外Kim等［14］的實(shí)驗(yàn)亦得出相同的結(jié)論。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)了抑制Bcl-2表達(dá)能顯著協(xié)同增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞放療所誘導(dǎo)的凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞的放射敏感性，為非小細(xì)胞肺癌的基因治療聯(lián)合放射治療研究提供了一些實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。然而還有許多問題需要解決，例如，人體內(nèi)實(shí)驗(yàn)是否和體外以及動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)具有相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，體內(nèi)細(xì)胞的微環(huán)境是否適合干擾基因的轉(zhuǎn)染及肺癌細(xì)胞是否會(huì)對(duì)其產(chǎn)生抗性，以及基因的轉(zhuǎn)染途徑及效率問題等。相信隨著基因治療和放療聯(lián)合治療策略的優(yōu)化，這些問題將會(huì)在以后的研究及工作中得到進(jìn)一步的論證及改善。

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