葉海波 時(shí)海波 于棟禎 陳正儂 殷善開

高膽紅素血癥對(duì)新生豚鼠畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射的影響*

葉海波1時(shí)海波1于棟禎1陳正儂1殷善開1

目的 通過動(dòng)態(tài)觀察高膽紅素血癥新生豚鼠畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射（DPOAE）及其對(duì)側(cè)抑制現(xiàn)象的變化，探討高膽紅素血癥對(duì)耳蝸和／或腦干聽覺傳出通路內(nèi)側(cè)耳蝸橄欖系統(tǒng)功能的影響。方法 20只新生豚鼠分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各10只，分別腹腔注射膽紅素100μg／g和等量生理鹽水。兩組于給藥前、給藥后2、4、6、8小時(shí)在對(duì)側(cè)耳無聲刺激及70 dB SPL白噪聲刺激兩種條件下測(cè)試DPOAE，觀察兩組DPOAE及對(duì)側(cè)抑制現(xiàn)象的動(dòng)態(tài)變化。給藥后8小時(shí)行全耳蝸基底膜鋪片定量觀察毛細(xì)胞損傷情況。結(jié)果 對(duì)照組給藥前后DPOAE幅值無變化，對(duì)側(cè)抑制現(xiàn)象始終存在。實(shí)驗(yàn)組給藥后DPOAE幅值逐步下降，給藥后2小時(shí)起對(duì)側(cè)抑制現(xiàn)象消失，其中5只豚鼠在給藥后8小時(shí)DPOAE幅值及對(duì)側(cè)抑制現(xiàn)象呈現(xiàn)不同程度的恢復(fù)。兩組豚鼠耳蝸基底膜鋪片觀察毛細(xì)胞形態(tài)未見異常。結(jié)論 高膽紅素血癥早期可能損害耳蝸毛細(xì)胞的主動(dòng)機(jī)械活動(dòng)及耳蝸傳出神經(jīng)系統(tǒng)，此損害部分為可逆性的。DPOAE及其對(duì)側(cè)抑制現(xiàn)象是評(píng)估膽紅素腦病嚴(yán)重程度的有效指標(biāo)。

高膽紅素血癥； 耳聲發(fā)射； 對(duì)側(cè)抑制； 耳蝸傳出系統(tǒng)

60%的新生兒可出現(xiàn)高膽紅素血癥，在某些患兒中可以誘發(fā)中樞神經(jīng)毒性作用，即膽紅素腦?。?］。由于聽覺系統(tǒng)對(duì)膽紅素毒性高度敏感，聽覺損傷常常先于其他中樞功能障礙，或者單獨(dú)顯癥，甚至在部分“生理性黃疸”患兒中也可出現(xiàn)各種急性或慢性顯現(xiàn)的聽功能損害［2，3］。大量的臨床及基礎(chǔ)研究提示高膽紅素可致聽覺外周與中樞均受損，然而，實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論并不一致［4～6］，而且缺乏高膽紅素血癥時(shí)有關(guān)聽覺外周與中樞功能的同步性研究的報(bào)告。

畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射（DPOAE）的幅值與耳蝸的主動(dòng)機(jī)制以及耳蝸外毛細(xì)胞的功能狀態(tài)相關(guān)。此外，腦干聽覺傳出系統(tǒng)也可影響DPOAE的幅值，一側(cè)聲刺激通過內(nèi)側(cè)耳蝸橄欖系統(tǒng)（medial olivocochlear system，MOCS）形成交叉至對(duì)側(cè)耳蝸的抑制性投射，可抑制對(duì)側(cè)耳蝸外毛細(xì)胞的主動(dòng)運(yùn)動(dòng)、抑制耳聲發(fā)射幅值［7，8］，此即為耳聲發(fā)射對(duì)側(cè)抑制效應(yīng)（contralateral suppression，CS）。本研究通過動(dòng)態(tài)觀察急性高膽紅素血癥新生豚鼠DPOAE、CS及耳蝸毛細(xì)胞圖的變化，探討高膽紅素血癥對(duì)耳蝸和／或腦干聽覺傳出通路功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和前期處理 選用生后5～7天的健康純白紅目豚鼠20只，體重70～120 g，雌雄不拘，耳廓反射靈敏，四肢運(yùn)動(dòng)自如，肌張力正常；顯微鏡下清除外耳道耵聹，檢查中耳無炎癥反應(yīng)。隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組和膽紅素實(shí)驗(yàn)組，每組各10只動(dòng)物。以鹽酸氯胺酮30 mg／kg行后肢肌肉注射麻醉，電熱毯維持肛溫在37.5～38.5℃，局部消毒后切除雙側(cè)耳屏軟骨至完全顯露外耳道口，徹底縫合止血，飼養(yǎng)2～3天傷口愈合后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在預(yù)實(shí)驗(yàn)探索測(cè)試技術(shù)的過程中發(fā)現(xiàn)，不切除耳屏的動(dòng)物測(cè)得的DPOAE值穩(wěn)定性相對(duì)較差，在某些頻率有5 dB左右的波動(dòng)；而切除耳屏后的測(cè)試結(jié)果穩(wěn)定，三次以上的DPOAE曲線可以達(dá)到完全重合，且對(duì)測(cè)試值的影響及動(dòng)物的傷害均不大，故在正式實(shí)驗(yàn)過程中均采用了上述處理方法。

1.2 高膽紅素血癥動(dòng)物模型制作 參照陳舜年等［9］的方法建立高膽紅素血癥豚鼠模型，膽紅素溶液均于注射前新鮮配制，避光保存及使用。稱取晶體膽紅素（Sigma公司），每20 mg溶于1 ml 0.5 M NaOH溶液中，加入雙蒸水9 ml，用0.5 M HCl調(diào)節(jié)p H至8.5。實(shí)驗(yàn)組豚鼠腹腔注射膽紅素劑量為100μg／g，對(duì)照組豚鼠腹腔注射等量的生理鹽水。

1.3 行為學(xué)評(píng)價(jià) 參照Shaia的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［5］，依據(jù)豚鼠神經(jīng)行為、軀體運(yùn)動(dòng)及對(duì)外界刺激的反應(yīng)，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物神經(jīng)行為學(xué)癥狀分為6個(gè)等級(jí)：0分為正常；1分為極輕度異常，表現(xiàn)為后肢共濟(jì)失調(diào)（運(yùn)動(dòng)失調(diào)）；2分為輕度異常，表現(xiàn)為后肢共濟(jì)失調(diào)和張力障礙，翻正反射輕度異常；3分為中度異常，表現(xiàn)為后肢共濟(jì)失調(diào)和張力障礙進(jìn)一步加重，翻正反射時(shí)間延長(zhǎng)；4分為重度異常，表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)減少、動(dòng)作遲緩，甚至俯伏不動(dòng)、對(duì)外界刺激無逃避反應(yīng)，偶爾表現(xiàn)興奮，易激惹，翻正反射消失；5分為瀕死狀，表現(xiàn)為發(fā)作性的角弓反張、癲癇發(fā)作和瀕死狀呼吸。

1.4 DPOAE檢測(cè) 兩組動(dòng)物均置于符合GB／T16403（1996）標(biāo)準(zhǔn)的隔聲屏蔽室中，采用美國(guó)GSI（格雷森－斯塔德勒公司）的GSI 60耳聲發(fā)射儀和診斷用聽力計(jì)（AA－38E，RION公司）行DPOAE及CS檢測(cè)。給藥前及給藥后2、4、6、8小時(shí)分別在對(duì)側(cè)耳無聲刺激及噪聲刺激兩種條件下測(cè)試DPOAE，記錄DPOAE及CS的動(dòng)態(tài)變化。

以自制固定器固定豚鼠頭部，將GSI 60耳聲發(fā)射儀探頭以自制橡膠耳塞封套后置于外耳道口，使外耳道完全密封。DPOAE記錄參數(shù)設(shè)置如下，原始純音頻率比f2／f1＝1.2，L1＝65 dB SPL，L2＝55 dB SPL，測(cè)定在f1＝1、1.3、1.6、2、2.5、3.2、4、5、6.4 k Hz 9個(gè)不同頻率時(shí)DPOAE的幅值，以DPOAE幅值大于本底噪聲3 dB SPL為引出標(biāo)準(zhǔn)。重復(fù)測(cè)試2～3次，取各頻率幅值的均值作為各頻率DPOAE的幅值。DPOAE測(cè)試完成后，將聽力計(jì)耳機(jī)插入對(duì)側(cè)外耳道口，用支架固定。在70 dB SPL白噪聲持續(xù)刺激下，記錄測(cè)試耳的DPOAE幅值，各項(xiàng)測(cè)量參數(shù)及方法同前。對(duì)側(cè)耳無聲刺激時(shí)DPOAE幅值與給予70 dB SPL白噪聲刺激時(shí)DPOAE幅值的差值計(jì)為△DPOAE，該差值即為對(duì)側(cè)抑制，反映耳蝸傳出系統(tǒng)功能狀態(tài)。每次測(cè)試間休息數(shù)分鐘，以減少因聽覺疲勞產(chǎn)生的影響。

1.5 耳蝸毛細(xì)胞圖 兩組動(dòng)物在給藥后8小時(shí)完成DPOAE檢測(cè)后均迅速于過量麻醉下斷頭處死，常規(guī)制備全耳蝸基底膜鋪片［10］，經(jīng)纖毛和表皮板染色（F－actin熒光染色法）后觀察。染色方法簡(jiǎn)述如下：將基底膜以0.01 M PBS中漂洗3次，每次5分鐘，隨后移入TRITC phalloidin（鬼筆環(huán)肽，Sigma P1951，1：400），避光放置30分鐘，取出樣品經(jīng)0.01 M PBS漂洗后鋪放于載玻片上的甘油中，基底膜的網(wǎng)狀膜面向上，蓋玻片覆蓋后周緣以中性樹膠封固，在熒光顯微鏡（尼康Eclipse 80i）下觀察。按丁大連等［9］的方法對(duì)內(nèi)、外毛細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并將結(jié)果逐一輸入LS軟件，該軟件自動(dòng)將輸入結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中健康豚鼠的耳蝸毛細(xì)胞參考值進(jìn)行比較并生成耳蝸毛細(xì)胞圖。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SAS 8.2統(tǒng)計(jì)軟件處理所有數(shù)據(jù)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以ˉx±s表示。兩組間DPOAE幅值的差異性采用單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)組豚鼠在有、無對(duì)側(cè)耳噪聲刺激下DPOAE反應(yīng)幅值之間的差異性采用配對(duì)t檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組行為學(xué)評(píng)分比較采用非參數(shù)分析法Kruskal－Wallis檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物模型鑒定及行為學(xué)評(píng)價(jià) 實(shí)驗(yàn)組豚鼠在給藥后2～8小時(shí)出現(xiàn)明顯的神經(jīng)行為學(xué)改變，以注射后8小時(shí)癥狀最為嚴(yán)重（表1）。行為學(xué)評(píng)分經(jīng)Kruskal－Wallis檢驗(yàn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)行為癥狀得分差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 DPOAE及CS 在對(duì)側(cè)耳無聲刺激狀態(tài)下，對(duì)照組給藥前、后檢測(cè)耳DPOAE幅值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)組給藥后各頻率DPOAE幅值下降，隨時(shí)間的推移其幅值進(jìn)一步下降；實(shí)驗(yàn)組給藥后2、4、8小時(shí)DPOAE幅值與對(duì)照組及給藥前相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

與對(duì)側(cè)耳無聲刺激相比，用藥前對(duì)側(cè)耳給予噪聲刺激兩組豚鼠的DPOAE幅值均有降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與給藥前相比，對(duì)照組給藥后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的△DPOAE未出現(xiàn)明顯變化（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)組給藥后各時(shí)間點(diǎn)之間的△DPOAE逐漸降低并最終趨于0，與給藥前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3）；其中5只豚鼠給藥后8小時(shí)△DPOAE有不同程度的恢復(fù)。

2.3 耳蝸毛細(xì)胞圖 與正常對(duì)照組豚鼠相比，實(shí)驗(yàn)組豚鼠腹腔注射膽紅素后8小時(shí)耳蝸基底膜鋪片及耳蝸毛細(xì)胞圖無異常（圖1、2）。

3 討論

大量的臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究［2，3，11］已經(jīng)證實(shí)高膽紅素血癥可損傷包括腦干聽覺核團(tuán)在內(nèi)的特定區(qū)域，如蒼白球、丘腦下核、海馬、動(dòng)眼神經(jīng)核、耳蝸腹側(cè)核及小腦皮層Purkinje細(xì)胞。膽紅素腦病是高膽紅素血癥常見的并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅人類的健康?，F(xiàn)已明確，未結(jié)合膽紅素，亦稱游離膽紅素是主要致病物質(zhì)，它可通過興奮毒性作用及影響能量代謝造成特定的中樞功能障礙［2，4］。豚鼠腹腔注射游離膽紅素溶液后，膽紅素經(jīng)體液吸收進(jìn)入血液循環(huán)，在給藥4～8小時(shí)后血清膽紅素濃度明顯增高，并出現(xiàn)異常神經(jīng)行為［9］。本研究使用的新生豚鼠聽力發(fā)育階段與新生兒相似，非常適合出生早期高膽紅素血癥導(dǎo)致聽覺損害的研究。

表1 兩組豚鼠各時(shí)間點(diǎn)的行為學(xué)評(píng)分（分）（n＝10）

表2 各頻率兩組豚鼠用藥前后DPOAE幅值變化

表2 各頻率兩組豚鼠用藥前后DPOAE幅值變化

注：*與前一個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，P＜0.05

f1（k Hz）對(duì)照組給藥前 給藥后2小時(shí) 給藥后4小時(shí) 給藥后8小時(shí)實(shí)驗(yàn)組給藥前 給藥后2小時(shí) 給藥后4小時(shí) 給藥后8小時(shí)1 5.05±2 5.69±2.89 5.8±1.84 5.35±2.63 7.1±2.84 4.1±2.18*3.55±1.45*2.55±0.56*1.3 6.9±4.32 7.94±3.38 7.65±4.9 7±4.03 8.2±5.42 6.2±4.61*4.45±2.57*4.6±2.12*1.6 9.9±4.43 12.19±6.63 11.25±6.87 10.75±5.82 5.25±2.9 2.9±1.89*3.2±1.54*2.65±1.79*2 13.9±8.47 16.06±8.6 16.05±7.59 15.35±6.77 7.65±4.14 4±2.89*3.3±1.99*3.1±1.22*2.5 16.65±7.62 17.69±7.5 18.1±7.98 17.35±8.63 10.15±4.22 7.35±2.84*6.9±2.44*5.4±3.02*3.2 15.7±6.09 16.75±6.92 16.4±6.66 16.35±5.86 15.05±2.92 10.7±2.55*8.45±4.55*6.1±4.63*4 11.95±6.47 15.38±4.59 13.95±4.42 13.8±4.02 16.95±1.98 13.15±3.33*8.5±6.67*5±2.99*5 11.8±5.99 14.38±5.68 15.7±4.38 14.75±5.29 18.5±2.45 15.3±1.62*11.3±4.91*10.4±4.06*6.4 19.8±6.54 21.19±6.19 20.05±5.5 20.75±5.28 26.4±5.24 24.9±4.03*21.25±6.44*17.25±9.3*

表3 各頻率兩組豚鼠給藥前后對(duì)側(cè)耳無聲刺激與對(duì)側(cè)耳給予70 d B SPL白噪聲時(shí)DPOAE振幅的差值（dB，n＝10）

圖1 兩組豚鼠給藥后8小時(shí)的耳蝸毛細(xì)胞缺失圖a.對(duì)照組（n＝10）；b.實(shí)驗(yàn)組（n＝10）

圖2 實(shí)驗(yàn)組給藥后8小時(shí)的耳蝸毛細(xì)胞鋪片，未見纖毛或表皮板損害表現(xiàn)（F－actin熒光染色×400）

對(duì)于高膽紅素血癥時(shí)耳蝸是否受累一直存在爭(zhēng)議。Lafreniere等［12］于1993年報(bào)道了在高膽紅素血癥患兒中能夠引出DPOAE，提示耳蝸功能正常，損害部位在蝸后。然而，Sheykholeslami等［13］對(duì)3例嚴(yán)重高膽紅素血癥所致聾兒的臨床研究表明，所有患兒的OAE（包括DPOAE和TEOAE）均異常，只能引出部分低頻或高頻的反應(yīng)，提示至少部分耳蝸外毛細(xì)胞功能受損。本研究中實(shí)驗(yàn)組豚鼠的耳蝸基底膜鋪片及耳蝸毛細(xì)胞圖顯示，新生豚鼠腹腔注射膽紅素后8小時(shí)的內(nèi)、外毛細(xì)胞圖正常，毛細(xì)胞的纖毛和表皮板未見損傷。這與Shapiro等［5，14］利用生后16至17天的先天性高膽紅素血癥大鼠模型（Gunn rat）檢測(cè)耳蝸微音器電位、耳蝸毛細(xì)胞鈣調(diào)節(jié)蛋白、微清蛋白的表達(dá)所證實(shí)的耳蝸毛細(xì)胞不受高膽紅素血癥影響的結(jié)果相符合。然而本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組豚鼠在給藥后各頻率的DPOAE振幅下降，且隨時(shí)間的推移逐步加重；給藥后8小時(shí)，行為學(xué)異常表現(xiàn)最為嚴(yán)重，DPOAE幅值下降也最顯著。推測(cè)DPOAE幅值下降的直接原因可能與高膽紅素血癥早期損害了耳蝸毛細(xì)胞耗能的主動(dòng)機(jī)械活動(dòng)有關(guān)。

王洪田等［15］研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物在去大腦強(qiáng)直后的DPOAE幅值顯著下降，提示聽皮層高級(jí)中樞對(duì)耳聲發(fā)射存在正向調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物出現(xiàn)了顯著的膽紅素腦病表現(xiàn)，因此，推測(cè)高膽紅素血癥時(shí)聽皮層功能受到抑制，聽皮層高級(jí)中樞對(duì)耳聲發(fā)射正向調(diào)控作用減弱，進(jìn)而導(dǎo)致DPOAE幅值下降。

對(duì)側(cè)聲刺激可抑制耳聲發(fā)射幅值的現(xiàn)象已在哺乳動(dòng)物及人類檢測(cè)中得到證實(shí)［16，17］。該現(xiàn)象的解剖學(xué)基礎(chǔ)在于，一側(cè)聲刺激可誘發(fā)交叉至對(duì)側(cè)MOCS的腦干聽覺傳出通路，并通過釋放乙酰膽堿影響MOCS傳出神經(jīng)纖維支配的外毛細(xì)胞，抑制對(duì)側(cè)外毛細(xì)胞的主動(dòng)運(yùn)動(dòng)，引起DPOAE幅值的下降［18～20］。因此，觀察耳聲發(fā)射的對(duì)側(cè)聲抑制現(xiàn)象可以了解聽覺腦干傳出通路的功能。本研究實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物在腹腔注射膽紅素后2小時(shí)即記錄不到CS，提示膽紅素作用后聲刺激無法興奮MOCS，因此，不能抑制對(duì)側(cè)外毛細(xì)胞的能動(dòng)性，DPOAE的幅值不再下降，說明高膽紅素血癥早期即可造成腦干聽覺傳出通路的病理性損害。實(shí)驗(yàn)組有5只豚鼠在給藥后8小時(shí)DPOAE幅值及CS出現(xiàn)不同程度的恢復(fù)，提示膽紅素對(duì)MOCS傳出神經(jīng)系統(tǒng)的損傷有部分是可逆的。

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（2009－11－09收稿）

（本文編輯 周濤）

Effect of HyperbiIirubinemia on Distortion Product Otoacoustic Emissions in Newborn Guinea Pigs

Ye Haibo，Shi Haibo，Yu Dongzhen，Chen Zhengnong，Yin Shankai
（Department of OtoIaryngoIogy，AffiIiated Sixth PeopIe’s HospitaI，Shanghai Jiao Tong University，Institute of OtoIaryngoIogy，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai，200233，China）

Hyperbilirubinemia； Otoacoustic emissions； Contralateral suppression； Medial olivocochlear system

10.3969／j.issn.1006－7299.2010.04.012

R764.5

A

1006－7299（2010）04－0350－05

* 2008年度上海市科委“創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目基金（08JC1412700）及2007年度教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金資助

1 上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，上海交通大學(xué)耳鼻咽喉科研究所，上海交通大學(xué)眩暈疾病診治中心，上海市聽力測(cè)試中心（上海 200233）

葉海波，男，上海人，主治醫(yī)師，在讀博士。研究方向：耳科學(xué)基礎(chǔ)和臨床。

時(shí)海波（Email：haibo99＠hotmail.com）

【Abstract】Objective To explore the function of cochlea and medial olivo cochlear system（MOCs）in hyperbilirubinemic guinea pigs by detecting the distortion product otoacoustic emissions（DPOAEs）and contralateral suppression（CS）.Methods The DPOAEs amplitude was measured with and without 70 d B SPL white noise contralateral stimulation in the ears of 20 healthy newborn guinea pigs，which were randomly divided into two groups（control group and experimental group）.DPOAE was recorded at 2，4，6 and 8 hours after peritoneal injection of saline for control group，and bilirubin for experimental group.Cochleogram was obtained from cochlear surface preparation in experimental group after the test.ResuIts There was no statistical change in DPOAEs amplitude and CS in control group.However，the amplitude of DPOAEs decreased in experimental group，the contralateral acoustic stimulation had no significant effect on amplitude of DPOAEs measured ipsilaterally after bilirubin injection.There was part of recovery on amplitude of DPOAEs and CSin five guinea pigs with no abnormalities in cochlear hair cells in experimental group at 8 hours after peritoneal injection.ConcIusion Our findings suggest that hyperbilirubinemia results in impairment of MOCs and mechanical activities of cochlear hair cells.The bilirubin injected animals showed some part of reversal of abnomalities.The DPOAEs and CS could be an effective ways to evaluate the severity of bilirubin encephalopathy.