鮑曉林 郭玉芬 劉曉雯 徐百成

西北地區(qū)與東北地區(qū)耳聾先證者線粒體DNA 12Sr RNA A1555G突變特點(diǎn)分析

鮑曉林1，2郭玉芬2劉曉雯2徐百成2

目的 分析西北地區(qū)耳聾先證者與東北地區(qū)線粒體DNA 12Sr RNA 1555位點(diǎn)的突變特點(diǎn)。方法對西北地區(qū)245例、東北地區(qū)188例耳聾先證者抽取靜脈血5～10 ml，提取白細(xì)胞DNA，針對線粒體DNA 12Sr RNA1555位點(diǎn)突變設(shè)計(jì)的一對引物序列進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction PCR），然后將擴(kuò)增產(chǎn)物用Alw26l限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，不能切開的送測序驗(yàn)證。結(jié)果 西北地區(qū)245例患者中，86例有氨基糖苷類藥物應(yīng)用史，檢測到21例線粒體DNA 12Sr RNA A1555G同質(zhì)型突變，突變檢出率為24.4%（21／86）；東北地區(qū)188例患者中，66例有氨基糖苷類藥物應(yīng)用史，檢測到2例同質(zhì)型突變，1例異質(zhì)性突變，突變檢出率為4.5%（3／66），兩地區(qū)比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.00）。結(jié)論 西北地區(qū)線粒體DNA 12Sr RNA A1555G突變檢出率顯著高于東北地區(qū)，提示在該地區(qū)應(yīng)加強(qiáng)藥物性聾的預(yù)防工作。

線粒體DNA； 12Sr RNA； 聾

藥物性聾是線粒體遺傳相關(guān)疾病，目前研究認(rèn)為，線粒體DNA12SrRNA A1555G突變促進(jìn)了氨基糖苷類抗生素與12Sr RNA結(jié)合，從而導(dǎo)致氨基糖苷類抗生素藥物致聾［1］。其耳聾表型的表達(dá)受環(huán)境因素、核基因背景以及線粒體DNA的單體型影響［2］。我國地域遼闊，遺傳性聾有很高的遺傳異質(zhì)性，為了進(jìn)一步探討不同地區(qū)線粒體遺傳性聾的分子流行病學(xué)的特點(diǎn)，本研究對西北地區(qū)和東北地區(qū)433例耳聾先證者進(jìn)行線粒體DNA 12Sr RNA 1555位點(diǎn)突變檢測，并分組進(jìn)行病因、病史等流行病學(xué)調(diào)查，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 研究對象來自于西北地區(qū)耳聾患者245例，其中男142例，女103例，年齡1～39歲，中位數(shù)15歲；東北地區(qū)耳聾患者188例，其中男112例，女76例，年齡2～23歲，中位數(shù)16歲。除外綜合征型聾以及因炎癥、外傷或全身疾病所致的耳聾病例。

1.2 調(diào)查方法

1.2.1 填寫問卷調(diào)查 根據(jù)王秋菊等［3，4］采用的遺傳性聾資源收集、保存的方法進(jìn)行聾病流行病學(xué)調(diào)查，主要包括患者耳聾的發(fā)生年齡、發(fā)病方式、耳聾的程度、感染史、發(fā)育史、母親的妊娠及分娩史、有無耳毒性藥物用藥史、有無耳聾高危新生兒疾病史以及有無其他系統(tǒng)疾病等。還需注意父母是否為近親結(jié)婚。對部分沒有得到詳細(xì)病史資料的學(xué)生通過電話詢問的方式進(jìn)行補(bǔ)充調(diào)查，完善問卷調(diào)查的內(nèi)容。

1.2.2 全身及耳鼻咽喉科常規(guī)檢查［5］特別注意全身發(fā)育、眼部及甲狀腺的檢查，以初步排除綜合征型聾，排除因中耳炎、腦膜炎、病毒性腦炎、腮腺炎及全身感染等因素所致的耳聾。

1.2.3 臨床聽力學(xué)檢測與評估 應(yīng)用純音測聽檢測聽力損失程度；按照Van Camp等［6］聽力損失分級標(biāo)準(zhǔn)評估聽力水平，根據(jù)受試者聽力較好耳0.5、1和2 k Hz純音聽閾平均值（PTA）進(jìn)行聽力分級（不能配合檢查的參考ABR閾值）：21～40 dB HL為輕度聾；41～70 d B HL為中度聾；71～95 dB HL為重度聾；＞95 dB HL為極重度聾。2歲以前聽力下降為語前聾，2歲以后聽力下降為語后聾。應(yīng)用Madsen901（丹麥）聲導(dǎo)抗檢測儀進(jìn)行鼓室導(dǎo)抗圖及鐙骨肌反射的檢測，了解中耳傳導(dǎo)狀況；應(yīng)用美國智聽公司Smart EP 3.X聽覺誘發(fā)電位儀行聽性腦干反應(yīng)檢查，測定反應(yīng)閾值及判斷是否存在蝸后病變。

1.3 基因檢測方法 所有耳聾患者及家系成員簽寫知情同意書。抽取所有患者及家系成員靜脈血5～10 ml，用酚氯仿法提取白細(xì)胞DNA。采用王秋菊課題組針對線粒體DNA 12Sr RNA1555位點(diǎn)突變設(shè)計(jì)的1對引物序列、反應(yīng)條件和反應(yīng)體系［7］，引物由上海生工公司合成，其他試劑由大連寶生物公司生產(chǎn)。PCR反應(yīng)體系在ABI公司9700熱循環(huán)儀完成。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取每種PCR產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)Marker各2μl，分別加入6μl溴酚藍(lán)，用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行產(chǎn)物純度和濃度的檢測。然后取擴(kuò)增產(chǎn)物6μl，加入Alw26l限制性內(nèi)切酶0.2μl和6×Buffer2μl，加水至20μl，在37℃水浴箱中溫育消化3小時(shí)，再次經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證酶切結(jié)果，酶切切開者電泳顯示為300 bp和500 bp兩個(gè)條帶，而不能切開的則為800 bp一個(gè)條帶。為驗(yàn)證酶切結(jié)果的準(zhǔn)確性全部送測序驗(yàn)證。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5軟件的列聯(lián)表（Grosstabs）對兩地區(qū)的結(jié)果差異進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

所有耳聾患者均為雙側(cè)感音神經(jīng)性聾。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，西北地區(qū)與東北地區(qū)耳聾患者在發(fā)病年齡、聽力損失程度和基因突變檢測結(jié)果的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表1）。線粒體DNA12Sr RNA A1555G突變均發(fā)生在有氨基糖苷類藥物應(yīng)用史的患者中。西北地區(qū)的突變檢出率為24.4%（21／86），東北地區(qū)為4.5%（3／66）。

表1 兩地區(qū)耳聾先證者的病因、病史、聽力損失程度及基因突變檢測結(jié)果（例）

3 討論

目前研究普遍認(rèn)為藥物性聾與遺傳密切相關(guān)，線粒體DNA 12Sr RNA A1555G的突變可造成患者對氨基糖苷類藥物易感性，是常見的致聾因素。研究藥物性聾的流行病學(xué)對藥物性聾的致聾機(jī)制研究尤為重要。我國幅員遼闊，民族眾多，人口分布和地域環(huán)境復(fù)雜多變，西北地區(qū)與東北地區(qū)地域環(huán)境、人口分布、風(fēng)土人情等都存在較大的差別，針對遺傳與環(huán)境的相關(guān)研究難度很大，群體遺傳規(guī)律以及遺傳與環(huán)境相互作用對藥物性聾存在哪些影響，是相關(guān)研究必須面對和亟待解決的問題。因此，開展藥物性聾的區(qū)域性流行病學(xué)調(diào)查，根據(jù)不同地區(qū)、不同人群中線粒體基因的突變特點(diǎn)，有針對性的進(jìn)行研究，更能夠客觀的反映我國藥物性聾的現(xiàn)狀。

本研究結(jié)果顯示，西北地區(qū)和東北地區(qū)均有三分之一以上的患者存在著濫用耳毒性藥物的問題，線粒體DNA 12Sr RNA A1555G突變均發(fā)生在有耳毒性藥物應(yīng)用史的患者中，在有氨基糖苷類藥物應(yīng)用史的患者中，西北地區(qū)的A1555G突變檢出率為24.4%（21／86），東北地區(qū)的突變檢出率則為4.5%（3／66），兩地區(qū)線粒體A1555G突變率存在差別，且發(fā)病年齡和耳聾表型方面兩地區(qū)也存在差異（P＜0.01），但由于樣本量較少，尚需要實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的不斷完善以及足夠樣本量的研究進(jìn)一步驗(yàn)證。線粒體DNA的其他致聾位點(diǎn)的突變是否存在差異還需要繼續(xù)研究。線粒體DNA1555位點(diǎn)的突變使得耳毒性藥物與該位點(diǎn)的結(jié)合更容易，可能是導(dǎo)致藥物性聾的發(fā)病率明顯提高的原因。由此看來，通過線粒體DNA 12Sr RNA A1555G突變檢測，對其突變家系的全體成員進(jìn)行有效的遺傳咨詢和用藥指導(dǎo)，嚴(yán)格控制氨基糖苷類抗生素等耳毒性藥物的應(yīng)用范圍和劑量等，為減低此類耳聾的發(fā)生有重要的作用。

1 Li XM，Guan MX.A human mitochondrial GTP binding protein related to tRNA modification may modulate phenotypic expression of the deafness－associated mitochondrial 12S r RNA mutation［J］.Molecular and Cellular Biology，2002，22：7 701.

2 徐延軍，曹菊陽，白琳娜，等.線粒體DNAA1555G和G7444A雙重突變導(dǎo)致的非綜合征型遺傳性耳聾［J］.中華耳科學(xué)雜志，2005，3：263.

3 王秋菊，楊偉炎，韓東一，等.遺傳性耳聾資源的收集、保存及利用——綜合系統(tǒng)的建立［J］.中華耳科學(xué)雜志，2003，1：65.

4 Stephens D，Lewis P，Davis A.The epidemiology of hearing problem：how should we investigate it［J］？Acta Otolaryngology，2004，522（suppl）：13.

5 謝鼎華，楊偉炎.耳聾的基礎(chǔ)與臨床［M］.長沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社，2007.116～149.

6 http：／／webhost.ua.ac.be／hhh／varia.Van Camp G，Smith RJH.Hereditary hearing loss homepage.Recommendations for the description of genetic and audiological data for families with nonsyndromic hereditary hearing impairment.

7 郭玉芬，徐百成，韓東一，等.中國西北地區(qū)線粒體DNA 12Sr RNA A1555G和GJB2基因突變［J］.中國耳鼻咽喉頭頸外科，2006，13：666.

（2009－12－09收稿）

（本文編輯 雷培香）

10.3969／j.issn.1006－7299.2010.04.021

R764.43

A

1006－7299（2010）04－0387－02

1 天津市泰達(dá)醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（天津 300457）； 2 蘭州大學(xué)第二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

郭玉芬（Email：eygyf＠yahoo.com）