，，

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

多粘菌素E (colistin) 是一類由多粘類芽孢桿菌 (Bacilluspolymyxinvar.colistinus) 產(chǎn)生的對革蘭氏陰性菌具有較強(qiáng)殺菌作用的多肽類抗生素[1].此類抗生素能有效預(yù)防動(dòng)物疾病并明顯促進(jìn)動(dòng)物生長，因而作為獸藥和飼料添加劑在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛應(yīng)用[2]，但是由于其代謝率低不能被動(dòng)物機(jī)體完全吸收，大部分被排出體外[3].有文獻(xiàn)表明：在土壤、水體以及動(dòng)植物性食品中都檢測到多肽類抗生素殘留，對人類健康構(gòu)成很大的危害[4-5].

抗生素的降解方式主要有水解、光解、氧化分解和生物降解.肖明威等[6]用光催化氧化法處理頭孢類抗生素廢水120 min，化學(xué)耗氧量 (Chemical oxygen demand，COD) 去除率達(dá)70.1%.生物降解主要是通過微生物作用使抗生素分解為CO2和H2O等無毒無害小分子的物質(zhì).趙永斌等[7]從長期受四環(huán)素類抗生素污染的土壤中分離到一株木糖氧化無色桿菌 (Achromobacterxylosoxidans)，它對土霉素、四環(huán)素和金霉素的降解率分別為65.78%，69.33%和71.34%.相比較于傳統(tǒng)的物理、化學(xué)方法，生物降解抗生素具有無毒害、無殘留、無二次污染和作用時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)[8]，已顯示出良好的應(yīng)用前景.然而關(guān)于生物降解多粘菌素E的研究卻鮮有報(bào)道，文獻(xiàn)分析顯示近半個(gè)世紀(jì)以來國內(nèi)外對多粘菌素的研究工作主要集中在藥物代謝、藥效分析和耐藥檢測等方面[9].筆者通過篩選得到一株能高效降解多粘菌素E的菌株，對其進(jìn)行分類鑒定，并研究其降解酶產(chǎn)生條件，為微生物治理多粘菌素殘留提供科學(xué)依據(jù)，也為微生物修復(fù)環(huán)境污染提供更多的選擇.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株

蛋白酶產(chǎn)生菌和大腸桿菌 (Escherichiacoli) DH5α均來自浙江工業(yè)大學(xué)微生物研究所前期保藏，菌株DC-01由本文鑒定.

1.1.2 培養(yǎng)基

降解菌培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，pH 7.0，250 mL燒瓶裝液量50 mL，121 ℃滅菌30 min.

降解酶篩選培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，pH 7.0，250 mL燒瓶裝液量50 mL，121 ℃滅菌30 min，多粘菌素E 5 000 U/mL過濾除菌.

降解酶發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖60 g/L，大豆蛋白胨40 g/L，Na2HPO4·12H2O 3 g/L，KH2PO40.3 g/L，pH 7.0，250 mL燒瓶裝液量50 mL，121 ℃滅菌30 min.

碳源選擇培養(yǎng)基：不同碳源 (碳摩爾數(shù)相同：葡萄糖60 g/L，蔗糖52 g/L，可溶性淀粉49 g/L)，大豆蛋白胨40 g/L，Na2HPO4·12H2O 3 g/L，KH2PO40.3 g/L，pH 7.0，250 mL燒瓶裝液量50 mL，121 ℃滅菌30 min.

氮源選擇培養(yǎng)基：葡萄糖60 g/L，不同氮源 (總氮量相同：大豆蛋白胨40 g/L，酵母粉30 g/L，硫酸銨34 g/L)，Na2HPO4·12H2O 3 g/L，KH2PO40.3 g/L，pH 7.0，250 mL燒瓶裝液量50 mL，121 ℃滅菌30 min.

1.1.3 主要儀器和設(shè)備

電子分析天平 (德國Sartorius TE612-L)，高壓整齊滅菌器 (日本Panasonic MLS-3781L)，恒溫振蕩培養(yǎng)器 (上海智誠 ZHWY-2102)，生化培養(yǎng)箱 (上海博訊 SPX-250B-Z)，核酸電泳裝置 (北京六一 DYY-8C).

1.2 方 法

1.2.1 多粘菌素E降解菌的富集與篩選

將蛋白酶產(chǎn)生菌在降解菌培養(yǎng)基固體平板上活化后，挑取新鮮菌落接入含有5 000 U/mL多粘菌素E的液體降解菌培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min下培養(yǎng)48 h后，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基中多粘菌素E效價(jià)濃度更高的搖瓶中進(jìn)行馴化，每次濃度提高2 000 U/mL.測定多粘菌素E的降解率來表征降解菌的產(chǎn)酶能力，通過蛋白酶產(chǎn)生菌對多粘菌素E降解效果的比較，篩選出降解能力強(qiáng)的降解酶產(chǎn)生菌株.

1.2.2 多粘菌素E降解菌的鑒定

菌株形態(tài)鑒定：采用降解菌培養(yǎng)基固體平板37 ℃培養(yǎng)降解菌24 h，對單菌落特征進(jìn)行觀察描述，按照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[10]進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色.

16S rRNA序列分析：采用DNA基因組快速提取試劑盒進(jìn)行總DNA提取，克隆引物采用細(xì)菌通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′和1492R：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′.PCR反應(yīng)體系：高保真2×phanta Max Master Mix 25 μL，引物27F和1492R各2 μL，基因組模板2 μL，加無菌水至50 μL.PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性15 s，52 ℃退火15 s，72 ℃延伸60 s，72 ℃徹底延伸5 min，30 個(gè)循環(huán).PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.2.3 菌體生物量測定

生長曲線測定：經(jīng)降解菌液體培養(yǎng)基活化后的菌懸液按體積比5%接種于降解酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)，以未接種培養(yǎng)基為對照，采用分光光度法檢測不同時(shí)間培養(yǎng)液的OD600，以測定菌體生長量.

菌體濕重測定：取1 mL發(fā)酵液于已知質(zhì)量M1的離心管中，8 000 r/min離心10 min，棄去上清液，吸水紙除去余水后稱量總質(zhì)量M2.總質(zhì)量M2減去離心管質(zhì)量M1即可獲得菌體濕重，計(jì)算公式為

菌體濕重M=M2-M1

1.2.4 培養(yǎng)條件對產(chǎn)酶的影響

采用單因素實(shí)驗(yàn)，將降解菌經(jīng)降解菌培養(yǎng)基活化后接種于降解酶篩選培養(yǎng)基中，分別在不同的溫度、pH、接種量、裝液量和碳氮源等條件下培養(yǎng)24 h.培養(yǎng)結(jié)束后發(fā)酵液4 ℃，8 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL加入終濃度為10 000 U/mL的多粘菌素E，于37 ℃下反應(yīng)1 h后測定多粘菌素E殘留量，每個(gè)處理設(shè)3 次重復(fù).

1.2.5 多粘菌素E降解率測定

參考高嵐等的抑菌圈法 (又稱一劑量法) 對多粘菌素E的殘留量進(jìn)行測定[11]：以E.coliDH5α為指示菌均勻涂布在固體降解菌培養(yǎng)基上，在固體平板上放置的牛津杯中加入200 μL的待測液后，4 ℃條件下冷擴(kuò)展12 h，再轉(zhuǎn)移到37 ℃條件下培養(yǎng)24 h.用高精度游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，經(jīng)校正后代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算多粘菌素E殘留濃度.

多粘菌素E殘留濃度mc計(jì)算公式為

mc=10(0.145 19d+1.140 08)R2=0.998 6

式中：mc為多粘菌素E殘留濃度；d為抑菌圈直徑校正值.

多粘菌素E降解率a計(jì)算公式為

a=(m0-mc)/m0×100%

式中m0為多粘菌素E初始濃度.

單位菌體降解量b計(jì)算公式為

b=(m0-mc)/M

式中M為菌體濕重.

2 結(jié)果與討論

2.1 降解酶產(chǎn)生菌的篩選與鑒定

多粘菌素E屬多肽類物質(zhì)，推測其降解酶可能是一種蛋白酶.以浙江工業(yè)大學(xué)微生物研究所保藏的蛋白酶產(chǎn)生菌為材料，通過測定不同菌株對多粘菌素E的降解率來表征產(chǎn)酶能力，比較酶活大小，篩選得到對多粘菌素E具有明顯降解效果的菌株DC-01.菌株DC-01在降解菌培養(yǎng)基平板上菌落呈扁平圓形、顏色灰白、邊緣不整齊、表面粗糙褶皺的特征.經(jīng)細(xì)胞染色及顯微鏡觀察，DC-01為革蘭氏陽性菌并且有芽孢產(chǎn)生 (圖1).

利用細(xì)菌基因組和16S rRNA通用引物克隆了DC-01菌株的16S rRNA部分序列，經(jīng)測序片段長度約1 427 bp.通過BLAST程序與GenBank (nr) 中的核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，在MEGA 5.0軟件中對同源性較近的細(xì)菌繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖2.菌株DC-01與大多數(shù)芽孢桿菌屬同源，其中與地衣芽孢桿菌 (B.licheniformis) WX-02置信度達(dá)到99%.因此，在分子系統(tǒng)發(fā)育分類學(xué)上筆者團(tuán)隊(duì)篩選到的多粘菌素E降解酶產(chǎn)生菌株屬于地衣芽孢桿菌，命名為地衣芽孢桿菌DC-01 (B.licheniformisDC-01).

圖1 降解菌DC-01菌落及菌體形態(tài)Fig.1 The colony and cellmorphology of degrading strain DC-01

圖2 降解菌B. licheniformis DC-01系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 The System evolution tree of B. licheniformis DC-01

2.2 培養(yǎng)條件對降解菌DC-01生長及其降解酶降解效果的影響

2.2.1 培養(yǎng)溫度對降解菌DC-01生長及降解效果的影響

溫度是影響有機(jī)體生長繁殖最重要的因素之一，任何的生化酶促反應(yīng)都與溫度相關(guān).將降解菌B.licheniformisDC-01經(jīng)活化后按5%接種量轉(zhuǎn)接至降解酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度分別為23，30，37，44，51 ℃條件下200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h.測定發(fā)酵液中的生物量及粗酶液對多粘菌素E的降解率，結(jié)果如圖3所示.培養(yǎng)溫度對B.licheniformisDC-01的生長和降解能力有顯著影響.溫度為23～44 ℃時(shí)，菌體濕重和多粘菌素E的降解率隨著溫度的升高而增加，在44 ℃時(shí)降解率達(dá)到最大值83.4%，但當(dāng)溫度繼續(xù)上升到51 ℃時(shí)，菌體量和多粘菌素E降解率訊速下降.由于單位菌體降解量基本相同，說明單位菌體內(nèi)的降解酶量是相近的.適宜的溫度只是促進(jìn)了菌體的生長，增加了菌體密度，從而提高了多粘菌素E的降解效率.降解菌最適的生長溫度是44 ℃，但是從實(shí)際應(yīng)用和經(jīng)濟(jì)效益出發(fā)，選用37 ℃作為適宜的培養(yǎng)溫度.

圖3 培養(yǎng)溫度對B. licheniformis DC-01的生長及其降解colistin能力的影響Fig.3 The effect of temperature to the growth of B. licheniformis DC-01 and colistin biodegradation

2.2.2 初始pH值對降解菌DC-01生長及降解效果的影響

pH值對微生物生長同樣具有顯著的影響，影響各種酶的活性.將降解菌B.licheniformisDC-01經(jīng)活化后按5%接種量轉(zhuǎn)接到初始pH值分別為5.0，6.0，7.0，8.0和9.0的降解酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h.測定發(fā)酵液中的生物量及粗酶液對多粘菌素E的降解率，結(jié)果見圖4.pH中性環(huán)境有利于地衣芽孢桿菌菌體的生長和降解酶的合成，而pH小于5的酸性環(huán)境不利于菌體生長，不同初始pH值對產(chǎn)物的合成也具有重要影響[12-13].由圖4可知：培養(yǎng)基初始pH值對降解菌B.licheniformisDC-01的生長和對多粘菌素E的降解都有影響.在初始pH值為7.0～8.0時(shí)降解效果最好，降解率達(dá)到79.5%，此時(shí)菌株生長也最旺盛.可見降解菌B.licheniformisDC-01在中性環(huán)境下對多粘菌素的降解效果最好，所以適宜產(chǎn)降解酶的初始發(fā)酵pH值為7.0～8.0.

圖4 初始pH對B. licheniformis DC-01的生長及降解colistin能力的影響Fig.4 The effect of pH value to the growth of B. licheniformis DC-01 and colistin biodegradation

2.2.3 接種量對降解菌DC-01生長及降解效果的影響

將降解菌B.licheniformisDC-01經(jīng)活化后分別按4%，6%，8%，10%和12%接種量轉(zhuǎn)接于pH為7.5的降解酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h.測定發(fā)酵液中的生物量及粗酶液對多粘菌素E的降解率，結(jié)果如圖5所示.當(dāng)接種量較低時(shí)，降解菌B.licheniformisDC-01的生物量和對多粘菌素E的降解率隨接種量的增加而升高，當(dāng)接菌量為8%時(shí)，其降解率達(dá)到最大值86.9%.當(dāng)接種量超過8%后，降解菌生物量保持穩(wěn)定但是降解效果有所下降.接種量增加，降解菌受培養(yǎng)基中營養(yǎng)的限制，各實(shí)驗(yàn)組生物量基本相同.增大接種量能夠縮短菌株生長的延滯期，但是接種量太大容易導(dǎo)致前期菌體生長過快，營養(yǎng)供應(yīng)不足，菌體提前進(jìn)入老化狀態(tài)[14-15].接種量過高或過低都會(huì)影響降解效果，因此選擇8%的接種量最適宜.

圖5 接種量對B. licheniformis DC-01的生長及降解colistin能力的影響Fig.5 The effect of bacterium quantity tothe growth of B. licheniformis DC-01 and colistin biodegradation

2.2.4 搖瓶裝液量對降解菌DC-01生長及降解效果的影響

搖瓶裝液量的高低影響溶氧量，溶氧對于菌體的生長和降解效果都有重大的影響.將降解菌B.licheniformisDC-01經(jīng)活化后按8%接種量轉(zhuǎn)接于pH 7.5，裝液量分別為30，50，70，90 mL的降解酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h.測定發(fā)酵液中的生物量及粗酶液對多粘菌素E的降解率.由圖6可知：當(dāng)裝液量為50 mL時(shí)，降解菌B.licheniformisDC-01對多粘菌素E的降解率達(dá)到最大值83.7%，但是裝液量30 mL時(shí)生長最好.裝液量低時(shí)溶氧量較高，此時(shí)菌株生長最旺盛，隨著裝液量增加溶氧降低，降解菌B.licheniformisDC-01的生物量呈現(xiàn)下降的趨勢，表明降解菌B.licheniformisDC-01屬于好氧菌.溶氧對微生物的影響分為兩方面：影響與生長有關(guān)的能量代謝和直接參與產(chǎn)物的合成.高濃度的溶氧能夠顯著促進(jìn)好氧菌B.licheniformisDC-01的生長，但是并不利于降解酶的合成分泌，因?yàn)槲⑸锷L最適溶氧與降解酶合成最適溶氧并不相同[16-17]，因此在搖床發(fā)酵條件下選擇50 mL的裝液量最適宜.

圖6 裝液量對B. licheniformis DC-01的生長及降解colistin能力的影響Fig.6 The effect of liquid volume to the growth of B. licheniformis DC-01 and colistin biodegradation

2.2.5 碳氮源對降解菌DC-01生長及降解效果的影響

不同的營養(yǎng)成分能夠影響生物體的生長和代謝途徑的改變.將降解菌B.licheniformisDC-01經(jīng)活化后按8%接種量轉(zhuǎn)接于pH為7.5、裝液量為50 mL的不同碳氮源選擇培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h.測定發(fā)酵液中的生物量及粗酶液對多粘菌素E的降解率.由圖7可知：有機(jī)氮源比無機(jī)氮源更有利于降解菌B.licheniformisDC-01的生長和降解酶的合成與分泌.有機(jī)氮源大豆蛋白胨和酵母粉含有豐富的蛋白質(zhì)、肽類，既能快速促進(jìn)菌體的生長,又能誘導(dǎo)多粘菌素E降解酶的合成.在碳源的選擇中，單糖葡萄糖、二糖蔗糖均優(yōu)于多糖淀粉，其中選用蔗糖時(shí)的降解率和生物量最大，分別為92.1%和39.7 mg.孫倩等[18]利用高地芽孢桿菌 (Bacillusaltitudinis) 發(fā)酵生產(chǎn)堿性蛋白酶時(shí)也發(fā)現(xiàn)蔗糖是菌體生長和產(chǎn)酶的最佳碳源.因此，降解菌B.licheniformisDC-01產(chǎn)降解酶的培養(yǎng)基中最適宜的碳氮源組合是蔗糖和大豆蛋白胨.

1-大豆蛋白陳；2-酵母粉；3-硫酸銨；4-葡萄糖；5-蔗糖；6-淀粉圖7 碳氮源對B. licheniformis DC-01的生長及降解colistin能力的影響Fig.7 The effect of carbon and nitrogen sources to the growth of B. licheniformis DC-01 and colistin biodegradation

3 結(jié) 論

筆者篩選得到一株高效降解多粘菌素E的菌株DC-01，經(jīng)形態(tài)觀察和16S rDNA鑒定為地衣芽孢桿菌 (B.licheniformis) 并命名B.licheniformisDC-01.降解菌DC-01合成降解酶的最適搖瓶發(fā)酵條件為：溫度37 ～44 ℃、初始pH值7.0～8.0、接種量8%、250 mL燒瓶裝液量50 mL、發(fā)酵培養(yǎng)基中碳氮源組合為5.2%蔗糖和4.0%大豆蛋白胨.在最適發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h，降解菌DC-01產(chǎn)生的粗酶液對10 000 U/mL多粘菌素E作用1 h的降解率達(dá)92.1%.

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