，，，,，

(1.蓮花健康產(chǎn)業(yè)集團股份有限公司 博士后科研工作站，河南 項城 466200；2.天津科技大學 生物工程學院，天津 300457； 3.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津 300457)

莽草酸(shikimate)，化學名稱3,4,5-三羥基-1-環(huán)己烯-1-羧酸，是合成芳香族氨基酸及有機酸的重要中間物.由于其獨特的化學結(jié)構(gòu)，可以被用來合成重要的化學品，如酚類、生物堿、吲哚衍生物和手性藥物等[1-2].更為重要的是，莽草酸是合成抗豬/禽流感藥物達菲的前體物[3-5].此外，莽草酸還被廣泛用作除草劑和抑菌劑[6]，以及應(yīng)用于有機化學和醫(yī)藥行業(yè)[5].莽草酸的現(xiàn)行生產(chǎn)方法主要是從八角果實中提取，其涉及步驟多、收率極低[7].微生物發(fā)酵法生產(chǎn)莽草酸是一種極具潛力的可持續(xù)的替代工業(yè)生產(chǎn)方法.目前，利用代謝工程構(gòu)建莽草酸生產(chǎn)菌株已成為研究熱點，包括大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌、枯草芽孢桿菌等[7-8].經(jīng)過多年的研究，科學家們已經(jīng)構(gòu)建了許多莽草酸生產(chǎn)菌株，有些莽草酸產(chǎn)量也比較高.然而，從莽草酸高產(chǎn)菌株的獲得到其工業(yè)化生產(chǎn)之間還必須進行發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化和發(fā)酵過程控制的系統(tǒng)研究.

本課題組在前期工作中獲得了一株大腸桿菌莽草酸生產(chǎn)菌，首先對其發(fā)酵培養(yǎng)基中碳氮源、金屬離子進行了單因素優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上，經(jīng)過正交實驗設(shè)計，對影響菌體生長和莽草酸產(chǎn)量的重要因素進行組合優(yōu)化，擬獲得適宜莽草酸發(fā)酵的培養(yǎng)基配方，為今后莽草酸工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的參考.

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 菌 株

莽草酸生產(chǎn)菌大腸桿菌(Escherichiacoli)SHIKΔaroL，保藏于天津科技大學代謝工程研究室.

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 2.5 g/L，瓊脂粉30 g/L.pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min.

種子培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，酵母粉2 g/L，蛋白胨2 g/L，檸檬酸三鈉1.6 g/L，(NH4)2SO41.2 g/L，K2HPO45.6 g/L，MgSO4·7H2O 1.6 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 2.8 mg/L，MnSO4·H2O 1.2 mg/L，VB11.3 mg/L，VH0.3 mg/L.pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min.

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖8 g/L，酵母粉1 g/L，蛋白胨5 g/L，牛肉膏1 g/L，玉米漿0.5 mL/L，檸檬酸2 g/L，(NH4)2SO41.6 g/L，K2HPO4·3H2O 7.5 g/L，MgSO4·7H2O 2 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 3 mg/L，鉬酸銨0.009 mg/L，硼酸0.17 mg/L，CoCl2·6H2O 0.047 mg/L，MnSO4·H2O 0.017 mg/L，CuSO4·7H2O 0.017 mg/L，ZnSO4·7H2O 0.02 mg/L.碳氮源和金屬離子優(yōu)化實驗中各物質(zhì)的含量根據(jù)實際情況添加.pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min.

1.1.3 主要儀器

生化培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠；振蕩培養(yǎng)箱，上海智誠分析儀器制造有限公司；數(shù)顯鼓風干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司；752型紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；SBA-40C生物傳感儀，山東省科學院；LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司.

1.2 發(fā)酵培養(yǎng)方法

1.2.1 菌種活化

從冷藏的菌種保藏斜面上或是保菌管中，用接種環(huán)接取適量菌體劃線接種到新鮮活化斜面，36 ℃恒溫培養(yǎng)16～20 h.再將斜面用無菌接種環(huán)轉(zhuǎn)接至新的斜面，繼續(xù)活化菌株，32 ℃培養(yǎng)20～24 h.

1.2.2 種子培養(yǎng)

將活化好的斜面，用接種環(huán)刮兩環(huán)接種至含30 mL種子培養(yǎng)基(含質(zhì)量分數(shù)4%的葡萄糖)的擋板瓶中.于36 ℃，200 r/min下?lián)u床培養(yǎng)，通過苯酚紅指示劑指示，用氨水調(diào)節(jié)pH為6.4～7.0.

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)

種子培養(yǎng)約10 h后，按體積分數(shù)10%的接種量轉(zhuǎn)接至終體積為30 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始葡萄糖質(zhì)量分數(shù)為4%.于36 ℃，200 r/min下?lián)u床培養(yǎng)，通過苯酚紅指示劑指示，用氨水調(diào)節(jié)pH為6.4～7.0.當?shù)滋窍膶⒔耆珪r補加0.5 mL質(zhì)量分數(shù)為60%的葡萄糖.

1.3 分析檢測方法

1.3.1 pH測定

使用pH 6.4～8.0精密pH試紙測定.

1.3.2 菌體生物量測定

菌體生物量以干重表示，取30 mL發(fā)酵液13 000 r/min離心20 min，棄上清，菌體用去離子水洗滌兩次，置于55 ℃恒溫干燥箱中至恒重.用分析天平稱重并計算每毫升發(fā)酵液所占的干重.

將發(fā)酵液稀釋不同倍數(shù)，采用752型分光光度計測定600 nm波長下的吸光度，使OD600處于0.2～0.8.以O(shè)D值為橫坐標，菌體干重為縱坐標繪制菌體干重曲線，獲得干重曲線方程為：Y=0.362 41X-0.011 39(R2=0.998 3；Y為菌體干重DCW，g/L；X為OD600).

所取發(fā)酵樣品稀釋一定倍數(shù)后，測定OD600，根據(jù)干重曲線求得菌體干重DCW.

1.3.3 葡萄糖濃度測定

采用SBA-40C生物傳感儀測定.

1.3.4 莽草酸濃度測定

采用高效液相色譜法測定.發(fā)酵液預(yù)處理：取1 mL發(fā)酵液于1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心2 min，取上清液稀釋5倍，稀釋液經(jīng)0.2 μm膜濾器過濾后置于4 ℃冰箱中待測.檢測條件：紫外檢測器，色譜柱為Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm，L×I.D.)；流動相為5 mmol/L硫酸，流速0.5 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長215 nm.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同氮源對菌體生長及產(chǎn)酸的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0，5，10，15，20 g/L的蛋白胨，對應(yīng)的菌體生物量和莽草酸產(chǎn)量如圖1(a)所示.當?shù)鞍纂速|(zhì)量濃度為0～15 g/L時，菌體干重隨著蛋白胨質(zhì)量濃度的升高而升高，當?shù)鞍纂速|(zhì)量濃度為20 g/L時，菌體干重略有下降.而莽草酸產(chǎn)量隨著蛋白胨質(zhì)量濃度的升高而一直上升.說明蛋白胨質(zhì)量濃度確實對菌體生長和產(chǎn)酸有顯著影響.

發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0，1，3，6，9 g/L牛肉膏，菌體生物量和莽草酸產(chǎn)量如圖1(b)所示.菌體干重基本隨著牛肉膏添加量的升高而不斷上升，而莽草酸產(chǎn)量基本保持不變.說明牛肉膏對菌體生長有一定作用，但對產(chǎn)酸沒有顯著影響.

發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加1，2，3，4 g/L的酵母粉，菌體生物量和莽草酸產(chǎn)量如圖1(c)所示.當酵母粉質(zhì)量濃度大于2 g/L時，菌體干重基本維持穩(wěn)定.酵母粉質(zhì)量濃度為2 g/L時，莽草酸產(chǎn)量達到最大，之后出現(xiàn)波動.說明酵母的添加對菌體生長有一定影響，對產(chǎn)酸沒有顯著影響.

發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0，0.5，1.0，1.5 mL/L的玉米漿，菌體生物量和莽草酸產(chǎn)量如圖1(d)所示.在所測試的玉米漿體積分數(shù)范圍內(nèi)，菌體干重和莽草酸產(chǎn)量出現(xiàn)小幅波動，基本保持不變，說明玉米漿的添加對菌體生長與產(chǎn)酸沒有顯著影響.

綜上所述，通過單因素發(fā)酵優(yōu)化實驗發(fā)現(xiàn)：蛋白胨對菌體生長和產(chǎn)酸都有促進作用；牛肉膏對菌體生長促進作用明顯，對產(chǎn)酸影響較小；酵母粉對菌體生長略有影響；玉米漿對菌株莽草酸發(fā)酵影響不大，可以忽略.因此，在后續(xù)正交實驗設(shè)計中，只對蛋白胨和牛肉膏進行優(yōu)化.趙現(xiàn)方等[9]對莽草酸發(fā)酵的碳氮源進行了優(yōu)化，也發(fā)現(xiàn)相較于豆餅粉和酵母膏等，蛋白胨和牛肉膏對莽草酸發(fā)酵的影響最大.

圖1 氮源對菌體生長及產(chǎn)酸的影響Fig.1 Influence of nitrogen sources on bacterial growth and shikimate production

2.2 葡萄糖質(zhì)量分數(shù)對菌體生長及產(chǎn)酸的影響

趙現(xiàn)方等[9]的研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖和果糖比甘油和蔗糖等更有利于莽草酸的生產(chǎn).筆者只選擇了發(fā)酵工業(yè)中常用的葡萄糖，考察初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖質(zhì)量分數(shù)對莽草酸發(fā)酵的影響.在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量分數(shù)為0.5%，1%，1.5%，2.0%，2.5%的葡萄糖，菌體生物量和莽草酸產(chǎn)量如圖2所示.菌體干重和莽草酸產(chǎn)量隨葡萄糖質(zhì)量分數(shù)的升高呈現(xiàn)先升后降趨勢，均在葡萄糖為1.5%時達到最大值，說明葡萄糖質(zhì)量分數(shù)對菌體生長與產(chǎn)酸有一定的影響.仲楠[10]研究結(jié)果表明：莽草酸產(chǎn)量隨著葡萄糖質(zhì)量分數(shù)的升高先增加后下降，在葡萄糖質(zhì)量分數(shù)為1.7%時達到最大值，與本實驗結(jié)果類似.

圖2 葡萄糖質(zhì)量分數(shù)對菌體生長及產(chǎn)酸的影響Fig.2 Influence of initial glucose content on bacterial growth and shikimate production

2.3 金屬離子對菌體生長及產(chǎn)酸的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量濃度為0，1，2，3 mg/L的FeSO4·7H2O，菌體生物量和莽草酸產(chǎn)量如圖3(a)所示.菌體干重隨FeSO4·7H2O質(zhì)量濃度的升高而不斷增加，在3 mg/L時達到最大值.莽草酸產(chǎn)量在FeSO4·7H2O質(zhì)量濃度為2 mg/L時升至最大值.說明鐵鹽的添加對菌體生長與產(chǎn)酸有一定的促進作用.在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量濃度為0.8，1.4，2，2.6 mg/L的MgSO4·7H2O，菌體生物量和莽草酸產(chǎn)量如圖3(b)所示.菌體干重隨著MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度的升高先增加后下降，在MgSO4·7H2O為1.4 mg/L時達到最大.莽草酸產(chǎn)量呈現(xiàn)小幅波動.

圖3 金屬離子對菌體生長及產(chǎn)酸的影響Fig.3 Effects of metal ions on bacterial growth and shikimate production

綜上所述，F(xiàn)eSO4·7H2O對菌體生長和莽草酸積累均具有較大影響，而MgSO4·7H2O對菌體生物量影響較大.就單因素結(jié)果而言，最佳FeSO4·7H2O質(zhì)量濃度為2 mg/L，最佳MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度為1.4 mg/L.然而，亞鐵離子和鎂離子為微量元素，少量添加對微生物生長具有不可或缺的作用，但其添加量需要嚴格控制.因此，在后續(xù)正交實驗中對這兩種金屬離子的用量也進行了優(yōu)化.

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基部分成分的正交實驗

通過以上單因素發(fā)酵優(yōu)化實驗，得出各因素對菌體生長和莽草酸積累的最適添加濃度.由于玉米漿對菌體生物量和莽草酸產(chǎn)量均無顯著影響，可以將其去除.選取最優(yōu)的酵母粉用量2 g/L，葡萄糖質(zhì)量濃度15 g/L，其他發(fā)酵培養(yǎng)基的成分保持不變，對牛肉膏、蛋白胨、MgSO4·7H2O和FeSO4·7H2O四種成分進行進一步正交優(yōu)化.實驗采用四因素三水平的L9(34)正交設(shè)計，各因素及水平見表1，莽草酸產(chǎn)量及均值分析見表2，顯著性統(tǒng)計分析見表3.

表1正交實驗因素水平表

Table1Factorsandlevelsinorthogonalexperiment

因素水平123A牛肉膏/(g·L-1)136B蛋白胨/(g·L-1)51015CMgSO4·7H2O/(mg·L-1)0．81．42．0DFeSO4·7H2O/(mg·L-1)123

表2莽草酸產(chǎn)量及均值分析

Table2Shikimateproductionandaverageanalysis

實驗設(shè)計A牛肉膏/(g·L-1)B蛋白胨/(g·L-1)CMgSO4·7H2O/(mg·L-1)DFeSO4·7H2O/(mg·L-1)莽草酸/(g·L-1)1150．824．39021101．443．59231152．063．0894351．463．99253102．024．67563150．844．2057652．044．14386100．863．20096151．423．861均值14．2913．7183．8153．427均值23．6903．8223．9693．980均值33．7354．1753．9324．309極差0．1960．1300．0810．275

極差分析：極差越大，表明因素的重要程度越高.由表2可知：四因素的極差排序為FeSO4·7H2O>牛肉膏>蛋白胨>MgSO4·7H2O，說明FeSO4·7H2O對實驗結(jié)果帶來的影響最大，其次為牛肉膏和蛋白胨，MgSO4·7H2O對實驗結(jié)果造成的影響最小.

表3顯著性統(tǒng)計分析1)

Table3Significantstatisticalanalysis

因素偏差平方和自由度F比F臨界值牛肉膏0．06921．2384．460蛋白胨0．02720．4844．460MgSO4·7H2O0．01320．2334．460FeSO4·7H2O0．11422．0454．460誤差0．2208

注：1) 在實驗水平α=0.05時，分別驗證各因素的顯著性.

通過對以上四組實驗結(jié)果的對比分析可知：菌體生物量及莽草酸產(chǎn)量在不同實驗組中相差較大，同組實驗則相差較小.

分別以各因素的水平變化為橫坐標，以莽草酸產(chǎn)量的均值為縱坐標，畫出水平與指標關(guān)系圖(圖4).從圖4可以看出：A2B1C3D1為最佳方案，符合表2中莽草酸產(chǎn)量最高時的因素組合.因此確定該培養(yǎng)基為大腸桿菌莽草酸發(fā)酵的最適培養(yǎng)基.具體配方為：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，MgSO4·7H2O 2 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 2 mg/L，酵母粉2 g/L，葡萄糖15 g/L，其他成分同材料與方法部分描述.通過培養(yǎng)基優(yōu)化后，莽草酸產(chǎn)量達到4.675 g/L，是優(yōu)化前1.453 g/L的3.22倍.

圖4 各因素水平與指標關(guān)系圖Fig.4 Correlation between levels and shikimate productions for each factor

3 結(jié) 論

本研究對大腸桿菌生產(chǎn)莽草酸的發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，顯著提高了莽草酸的產(chǎn)量.首先通過單因素優(yōu)化實驗發(fā)現(xiàn)，與酵母粉和玉米漿相比，蛋白胨和牛肉膏對菌體生長和莽草酸產(chǎn)量影響較大，初始葡萄糖、MgSO4·7H2O和FeSO4·7H2O濃度均對菌體干重和莽草酸產(chǎn)量產(chǎn)生較大影響.通過正交實驗對這四個因素進行進一步優(yōu)化，獲得最佳莽草酸發(fā)酵培養(yǎng)基，此時莽草酸產(chǎn)量達到4.675 g/L，為培養(yǎng)基優(yōu)化前的3.22倍.

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