，，，

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014；2.金華市食品藥品檢驗檢測研究院，浙江 金華 321000)

果膠低聚糖(POS)，又稱低聚半乳糖醛酸，由2～20 個半乳糖醛酸通過α-1,4-糖苷鍵連接而成，是一類新型的益生元[1]，研究表明其具有抗菌[2]、促雙歧桿菌生長[3-4]以及抗腫瘤[5]、抗氧化[6]、提高機體的免疫調(diào)節(jié)能力等[7]生理活性，具有較大的研究價值和應(yīng)用前景.目前，POS可以通過酸水解[8]和熱液處理等化學(xué)法得到，也可以通過特定原料的解聚或酶水解果膠純品[9-11]制備得到.聚半乳糖醛酸酶(PG)是常用的果膠酶[12-13]，可作用于兩個非酯化半乳糖醛酸間的糖苷鍵，從而使果膠達到降解的效果.

果膠低聚糖自發(fā)現(xiàn)以來，國外研究者著重于其對植物的生理活性研究，作為植物抗病防病的誘導(dǎo)劑，但對其抑菌活性關(guān)注甚少.雖然目前利用果膠酶水解獲得的果膠低聚糖的抑菌活性研究為數(shù)不多，但現(xiàn)有研究成果表明果膠分解物對常見的食品污染細菌有明顯的抑制作用[14].因此，相比化學(xué)防腐劑的毒性，果膠低聚糖無疑是一種極具開發(fā)價值的新型天然食品防腐劑.此外，我國的果膠資源豐富[15]，柑橘皮渣、蘋果皮渣、向日葵盤和甜菜渣等含有大量的天然果膠，均可以用于制備價格低廉、功效獨特的果膠低聚糖產(chǎn)品.

1 材料與方法

1.1 菌 種

食品常見細菌：大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcuseureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubltillus).以上菌種均由浙江工業(yè)大學(xué)微生物實驗室提供.

1.2 實驗材料

聚半乳糖醛酸酶(PG)購于廣州利華有限公司；普通果膠(DE 65.8%)由衢州果膠有限公司提供；乳酸鏈球菌素(QB2394-98)購于浙江銀象生物工程有限公司；山梨酸鉀、苯甲酸鈉均為市場食品防腐劑，購于上海阿拉丁生化科技有限公司；D-半乳糖醛酸、七聚半乳糖醛酸(純度均為98%)和低聚木糖(食品級市售低聚糖，聚合度2～9)購于上海百靈威化工有限公司；麥芽糖、半乳糖和D-木糖和鼠李糖等藥品購于中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑有限公司，純度均為95%.

1.3 培養(yǎng)基

細菌培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基)：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂15～20 g/L，pH 7.0～7.2.

真菌培養(yǎng)基(馬玲薯培養(yǎng)基，PDA)：馬玲薯200 g/L，蔗糖20 g/L，瓊脂15～20 g/L，pH自然.

1.4 酶活力的測定

聚半乳糖醛酸酶(PG)活力的測定：3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測定還原糖[16].酶活單位(U)：每分鐘產(chǎn)生1 μg半乳糖醛酸所需的酶量為1 個單位聚半乳糖醛酸酶(PG)酶活.

1.5 飽和果膠低聚糖的制備

取2 g酯化度為65.8%的果膠溶于100 mL的pH為4.2的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，加入0.4 g果膠PG酶(178.03 U/mL)，45 ℃下酶解4 h.每隔0.5 h取一次樣，離心處理，保存?zhèn)溆?

純化處理：果膠低聚糖初樣中接入2%活化好的酵母，于30 ℃發(fā)酵12～48 h，得到除去單糖的果膠低聚糖酵母發(fā)酵液.離心除去酵母菌體后的上清液用孔徑為5 000 Da濾膜超濾，獲得果膠低聚糖超濾液.

1.6 果膠低聚糖水解度、聚合度和分子量的測定

1.6.1 果膠低聚糖的水解度測定

利用DNS測糖法[16]測定果膠水解度.

1.6.2 高效液相色譜法測定低聚糖聚合度

色譜條件：Waters 1525泵、Waters 2414示差檢測器和Waters 2487紫外檢測器.Adsorbsphere NH2色譜柱，進樣量10 μL，流動相：V(乙腈)∶V(水)=85∶15，流動相流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，檢測波長245 nm.

對照品：1%的鼠李糖溶液，0.5%的半乳糖溶液(純度98%)，0.5%的D-木糖，0.5%的半乳糖醛酸溶液，0.5%的麥芽糖溶液，0.1%的七聚半乳糖醛酸溶液(純度98%)，0.5%的聚合度為2～9的木糖低聚糖溶液.鼠李糖的保留時間為5.415 min，半乳糖保留時間8.082 min，D-木糖保留時間為6.465 min.半乳糖醛酸保留時間為9.382 min.麥芽糖的保留時間為15.698 min.七聚半乳糖醛酸的保留時間為24.132 min.

1.7 果膠低聚糖與食品防腐劑的抑菌活性比較

采用杯碟法[17]測定果膠低聚糖與食品防腐劑對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌直徑.

最低抑菌濃度(MIC)[18]：將待測抑菌試劑進行倍數(shù)稀釋，各取1.0 mL加入到含2.0 mL培養(yǎng)基的無菌試管中，接入1.0 mL菌懸液，充分振蕩均勻，使各管中含菌量約為107～108cfu/mL，培養(yǎng)1～2 d.培養(yǎng)完成后觀察試管內(nèi)溶液是否清亮，分別取500 μL涂布于平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)1～2 d，觀察有無菌落生長.以無菌生長的試劑最低濃度為MIC.另設(shè)含等體積不添加試劑的緩沖液作陰性對照，以及添加無菌水和藥物的培養(yǎng)基為空白對照，每種處理設(shè)3 個平行.

防腐實驗：供試桔子若干，用榨汁機鮮榨果汁，適當(dāng)稀釋處理.取若干試管，每管注入10 mL桔子汁，經(jīng)巴氏滅菌后，注入一定濃度的防腐試劑1 mL，取兩支試管，將未經(jīng)防腐藥物處理的供試樣品直接裝入試管中，分別注入1 mL pH為4.2的緩沖液作為對照.37 ℃下培養(yǎng)，觀察防腐效果.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同酶解時間制備的果膠低聚糖對抑菌活性的影響

聚半乳糖醛酸酶降解果膠的過程中，先降解成多聚寡糖，再解聚為低聚寡糖和單糖.因此，水解液中還原糖含量的高低可以表征果膠的水解度.由圖1可知：當(dāng)水解時間達到180 min時，果膠水解液的吸光值達到最大，之后隨時間的延長，基本維持不變，表明果膠在180 min已基本水解完成.

不同水解時間獲得的果膠低聚糖的抑菌活性不同.將間隔30 min獲得的果膠低聚糖超濾離心后，高壓滅菌10 min，利用杯碟法檢測果膠低聚糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌效果.圖2表明：只有水解到一定程度的果膠低聚糖才能表現(xiàn)出很好的抑菌活性，且不同菌種對不同聚合度低聚糖的敏感程度不同.當(dāng)水解時間大于90 min，果膠低聚糖對金黃色葡萄球菌顯示很好的抑菌活性，其抑菌圈直徑大于2 cm.而對于芽孢桿菌，當(dāng)水解時間大于180 min，其抑菌活性明顯上升，表明只有聚合度低的糖類物質(zhì)才對其有較強的抑菌作用.相對于上述兩種菌，大腸桿菌對果膠低聚糖的敏感度較低，隨水解時間的延長，抑菌直徑無顯著增大.

圖1 不同酶解時間制備的果膠低聚糖Fig.1 The absorbency of pectic oligosaccharides along with different enzymatic hydrolysis time

圖2 不同酶解時間制備的果膠低聚糖對抑菌活性的影響Fig.2 The effect on bacteriostatic activity of the pectic oligosaccharides along with different enzymatic hydrolysis time

2.2 不同初始pH下酶解制備的果膠低聚糖對抑菌活性的影響

選取敏感度高的金黃色葡萄球菌為參考菌，分別比較pH 3.0，4.2，5.4，6.8條件下酶解制備的果膠低聚糖的抑菌效果，結(jié)果如圖3所示.由圖3可知：在pH 4.2條件下，聚半乳糖醛酸酶水解果膠低聚糖效果最佳，此時不僅水解物中還原糖半乳糖醛酸末端含量最高，水解率達到最大，而且該水解條件下制得的飽和低聚糖的抑菌活性最高.

圖3 不同初始pH下酶解制備的果膠低聚糖對抑菌活性的影響Fig.3 The effect on bacteriostatic activity of pectic oligosaccharides along with different original pH value of enzymatic hydrolysis

2.3 飽和果膠低聚糖的檢測分析

利用聚半乳糖醛酸酶可以獲得一系列聚合度的果膠低聚糖：已知在相同液相條件下七聚糖的保留時間為24.132 min，對照圖4中各峰的保留時間可知果膠低聚糖液中已含有一定量的聚合度小于7的低聚糖，而聚合度7以上的果膠低聚糖占80%以上.

圖4 果膠低聚糖液的高效液相色譜分析Fig.4 HPLC analysis of pectic oligosaccharides

2.4 果膠低聚糖與食品防腐劑的抑菌活性比較

2.4.1 抑菌圈的比較

由表1可知：同一質(zhì)量濃度的果膠低聚糖對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最佳，其次為大腸桿菌和枯草芽孢桿菌.當(dāng)果膠低聚糖質(zhì)量濃度為0.84 g/L時，其對金黃色葡萄球菌的抑制效果比苯甲酸鈉、山梨酸鉀和乳酸鏈球菌素好；當(dāng)果膠低聚糖質(zhì)量濃度為1.68 g/L時，其對三種菌的抑菌作用可以與各個食品防腐劑媲美；而當(dāng)果膠低聚糖質(zhì)量濃度為2.52 g/L時，其抑菌效果已經(jīng)超過了幾種食品防腐劑.果膠低聚糖作為一種天然的具有生物活性的低聚糖有著其他食品防腐劑不可比擬的優(yōu)勢，因此有望成為一種新型的防腐添加劑應(yīng)用于食品和化妝品行業(yè).

表1果膠低聚糖與食品防腐劑的抑菌活性比較

Table1Thecomparisonofantibacterialactivitybetweenpectinoligosaccharidesandfoodpreservatives

防腐試劑質(zhì)量濃度/(g·L-1)抑菌圈直徑D/cm大腸桿菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌果膠低聚糖0．841．461．431．251．681．631．801．652．522．102．211．92苯甲酸鈉0．101．601．351．500．251．751．701．750．502．082．152．10山梨酸鉀0．101．320．911．430．251．671．511．600．502．201．721．91乳酸鏈球菌素0．101．100．881．150．251．221．271．250．501．502．101．54

2.4.2 最低抑菌濃度(MIC)比較

由表2可知：果膠低聚糖的最低抑菌濃度范圍為0.11～0.21 g/L，不同菌種對濃度的敏感度有高低，結(jié)果表明果膠低聚糖對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度(MIC)分別為0.12，0.16，0.18 g/L.

測得市售食品防腐劑的最低抑菌濃度，并與果膠低聚糖比較，結(jié)果如表2所示.雖然化學(xué)防腐劑中苯甲酸鈉和山梨酸鉀的抑菌效果相對較好，但其高毒性嚴重影響其在食品行業(yè)的應(yīng)用.比較果膠低聚糖與生物防腐劑乳酸鏈球菌素(Nisin)發(fā)現(xiàn)，果膠低聚糖對三種菌株的最低抑菌濃度基本都低于Nisin.此外，觀察抑菌圈直徑發(fā)現(xiàn)Nisin對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌性能相對較低，而果膠低聚糖則有較好的抑制作用.因此，果膠低聚糖是食品行業(yè)中潛在的新興的天然食品防腐劑，市場應(yīng)用前景廣闊.

表2食品防腐劑最低抑菌濃度(pH4.2)

Table2MICoffoodantiseptictowardsthreetestmicrobes

防腐試劑最低抑菌濃度/(g·L-1)大腸桿菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌果膠低聚糖0．160．120．18苯甲酸鈉0．010．010．01山梨酸鉀0．050．030．05乳酸鏈球菌素1．500．850．50

2.4.3 對桔汁的防腐效果比較

選用不同質(zhì)量濃度的果膠低聚糖和市售食品防腐劑對鮮榨桔子汁進行防腐實驗.每隔24 h觀察一次，共觀察5 d.肉眼觀察桔子汁的清亮度，結(jié)果如表3所示.果膠低聚糖對桔子汁的防腐效果良好，顏色基本清亮.加入低質(zhì)量濃度的果膠低聚糖的2 個桔子汁樣品直到第5天，才稍顯混濁；化學(xué)防腐劑苯甲酸鈉和山梨酸鉀在質(zhì)量濃度為2 g/L時才能維持抑菌功效；而乳酸鏈球菌素由于抗菌譜較窄的缺點，對桔子汁的防腐效果相對較差.結(jié)果證明：果膠低聚糖可以有效地抑制食品中污染細菌的生長，具有良好的食品防腐效果.

表3桔子汁的清亮度變化1)

Table3Changeoftheorangejuicebrightness

防腐試劑質(zhì)量濃度/(g·L-1)不同時間桔子汁清亮度24h48h72h96h120h果膠低聚糖0．21----+-0．84----+-1．68-----苯甲酸鈉0．02--++++++0．20---+-+2．00-----山梨酸鉀0．02--++++++0．20---+-++2．00----+-乳酸鏈球菌素0．05-+-+++++++++0．50--++++++1．00--++++++5．00----+對照(pH4．2緩沖液)+-+++++++++++

注：1) “-”表示清亮透明；“+-”表示略微混濁；“+”表示混濁，且“+”越多，表示雜菌越多，試樣越混濁.

3 結(jié) 論

45 ℃下水解果膠(質(zhì)量濃度20 g/L)，PG加酶量為4 g/L (178.03 U/mL)，pH 4.2，水解180 min左右能夠獲得較好抑菌效果的飽和果膠低聚糖，高效液相分析其聚合度大于7.制備的果膠低聚糖對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌具有良好的抑制活性.根據(jù)對桔子汁澄清度的觀察，發(fā)現(xiàn)果膠低聚糖的防腐效果比市售防腐劑顯著.因此，果膠低聚糖能夠作為新型防腐劑應(yīng)用于食品行業(yè)，市場前景廣闊.

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