，，，， ，

(1.杭州華東醫(yī)藥集團有限公司，浙江 杭州 311000；2.浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院 浙江省生物有機合成技術(shù)研究重點實驗室，浙江 杭州 310014)

他克莫司(Tacrolimus)，又名FK506，是從筑波鏈霉菌發(fā)酵液中提取得到的一種大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，主要通過抑制T細(xì)胞活化相關(guān)細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄及其蛋白的表達(dá)發(fā)揮免疫抑制作用，其IC50為環(huán)孢素A的1%[1].1984年由日本藤澤藥品工業(yè)公司開發(fā)，其后國內(nèi)外大力進行了他克莫司的基礎(chǔ)和臨床研究.該產(chǎn)品為單水合物，白色或類白色結(jié)晶性粉末，幾乎不溶于水，易溶于乙醇、甲醇、丙酮、醋酸乙酯、乙醚、苯酚和氯仿[2-3]，具有藥效強、使用劑量低、移植物存活率高和急性排斥反應(yīng)發(fā)生率低等優(yōu)點[4].目前，國內(nèi)的免疫抑制劑市場已經(jīng)達(dá)到100 億元的規(guī)模，其中國內(nèi)重點城市公立醫(yī)院他克莫司用藥金額為5.03 億元，而全球他克莫司市場一直處于20多億美元的規(guī)模，他克莫司已成為器官移植免疫抑制劑市場的領(lǐng)頭羊.

他克莫司作為一種具有獨特化學(xué)結(jié)構(gòu)和重要藥理活性的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，其生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法和生物發(fā)酵法.他克莫司的化學(xué)合成法最早是由Merck公司開發(fā)的不對稱Evans-Aldol縮合反應(yīng)法[5]，該方法先通過合成各關(guān)鍵片段再進行結(jié)構(gòu)單元的組裝得到最終產(chǎn)品，但由于他克莫司的分子量大、手性及結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因此在合成過程中所需步驟較多，合成效率相對較低.隨著研究者們對合成方法的不斷探索和改進，發(fā)展了新的合成方法，并改進了部分結(jié)構(gòu)單元的合成路徑，衍化出目前較常用的匯聚式合成策略[6].但由于化學(xué)合成方法的限制較多，隨著人們對他克莫司生物合成機制及特異性前體形成機制研究的不斷深入，科研人員可以通過基因工程改造的方法獲得產(chǎn)量提高、組分優(yōu)化的新一代他克莫司生產(chǎn)菌株.研究者們通過位點特異性整合的方法獲得了基因重組菌，其生產(chǎn)能力較原始菌株提高了120%.2003年，Kang等[7]篩選到了一株高產(chǎn)他克莫司的鏈霉菌StreptomycesclavuligerusCKD1 119，并提供了一種高產(chǎn)他克莫司的方法，經(jīng)過7～8 d的發(fā)酵，最終得到350 mg/L的他克莫司.后期研究者們不斷對菌株進行改良和發(fā)酵條件優(yōu)化，最終其生產(chǎn)能力有了很大的提高.此外，在他克莫司的下游分離提取方面，因發(fā)酵液中含有較多的成分，且他克莫司在含水溶媒體系中易發(fā)生互變異構(gòu)[8]，大大增加了精制過程的難度，一般認(rèn)為不能以反相柱色譜精制.Kino[9]和Okuhara[10]報道了他克莫司的分離提取方法，但都難以適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn).筆者通過選育高產(chǎn)突變株，突破發(fā)酵工藝的關(guān)鍵技術(shù)，改進下游分離純化工藝，全面提高發(fā)酵水平，降低雜質(zhì)含量，大幅降低生產(chǎn)成本，獲得先進的他克莫司生產(chǎn)新工藝.

1 材料與方法

1.1 菌 種

筑波鏈霉菌(Streptomycestssukubaensis)No 9993，由實驗室分離并保藏.

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基

麥芽浸出粉20 g/L，酵母浸出粉5 g/L，葡萄糖10 g/L，瓊脂15 g/L，pH 7.0.

1.2.2 種子培養(yǎng)基

可溶性淀粉10 g/L，甘油10 g/L，干酵母5 g/L，玉米漿10 g/L，葡萄糖10 g/L，CaCO32 g/L，pH 7.0.

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

糊精7%，固體玉米漿0.5%，啤酒酵母粉1.7%，面包酵母粉0.6%，L-異亮氨酸0.5%，硫酸銨0.1%，碳酸鈣0.25%，泡敵0.3%.

1.2.4 補料培養(yǎng)基

糊精7%，固體玉米漿0.5%，啤酒酵母粉1.7%，面包酵母粉0.6%，L-異亮氨酸0.5%，硫酸銨0.1%，碳酸鈣0.25%，泡敵0.3%，固體玉米漿0.1%，啤酒酵母粉0.5%，pH 9.0±0.5.

1.3 實驗方法

1.3.1 補料分批發(fā)酵方法

從新鮮斜面上挑取1 環(huán)菌接種到20 mL種子培養(yǎng)基中，300 r/min培養(yǎng) 40 h，制備一級種子，按體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接入20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中.

1.3.2 活性炭脫色損失計算

在萃取液中分別加入20 g/L的活性炭，攪拌2 h后過濾，得到濾液.

脫色損失率=(U萃取-U濾液)/U萃取×100%

式中：U萃取為萃取液效價；U濾液為濾液效價.

2 結(jié)果與討論

2.1 種子液碳源的篩選

淀粉是發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的必需碳源之一，但含淀粉的培養(yǎng)基黏度極高，從而影響發(fā)酵過程的供氧.為了探究種子對不同碳源的利用情況和適應(yīng)程度，考察了五種不同碳源(玉米淀粉(10 g/L)、可溶性淀粉(10 g/L)、甘油(10 g/L)、葡萄糖(5 g/L)和麥芽糊精(10 g/L))對種子生長(38 h)及對發(fā)酵產(chǎn)他克莫司的影響.結(jié)果如圖1所示.

圖1 不同碳源對發(fā)酵效價的影響Fig.1 The effect of carbon source on fermentation titer

由圖1可知：種子液碳源為葡萄糖、可溶性淀粉和麥芽糊精時，發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的效價均較高；而用玉米淀粉和甘油為碳源時，發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的效價相對較低.后期通過鏡檢發(fā)現(xiàn)以葡萄糖為種子液碳源時菌絲生長快，菌絲體粗壯，菌絲生長呈網(wǎng)狀，染色深，菌體對生長環(huán)境具有較大的耐受能力.

2.2 種子液中葡萄糖用量的優(yōu)化

對種子培養(yǎng)基中碳源葡萄糖的質(zhì)量濃度進行考察.種子培養(yǎng)48 h后移入發(fā)酵培養(yǎng)基，考察種子培養(yǎng)基中葡萄糖的添加量對發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的影響，以確定葡萄糖的最適用量.結(jié)果如圖2所示.

圖2 種子液中葡萄糖添加量對發(fā)酵效價的影響Fig.2 The effect of addition of glucose on fermentation titer

種子液中葡萄糖質(zhì)量濃度的高低會影響菌體生長速率，進而影響后續(xù)代謝產(chǎn)物的合成，因此需要選擇合適的葡萄糖質(zhì)量濃度以優(yōu)化菌體的代謝過程.由圖2可知：種子培養(yǎng)過程中碳源葡萄糖的質(zhì)量濃度為1.5 g/L時，后續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的水平可以達(dá)到287 μg/mL，此時菌絲鏡檢成網(wǎng)成團，菌絲粗壯，染色深.當(dāng)種子液中的葡萄糖質(zhì)量濃度較低時種子液中的碳源減少，種子生長速率下降；而當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度過高時，菌種生長速率過快，積累大量代謝副產(chǎn)物.因此，本實驗優(yōu)化所得到的1.5 g/L葡萄糖質(zhì)量濃度適合菌體生長代謝.

2.3 種子培養(yǎng)時間的確定

選用1.5 g/L葡萄糖作為種子碳源后，種子生長較快，生長周期發(fā)生了變化.種子培養(yǎng)時間直接影響產(chǎn)物的生成，為了確定較適宜的接種時間，實驗分別選取不同種齡(24，32，40，48，56 h)的種子接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，并最終以發(fā)酵液中的他克莫司效價判斷發(fā)酵的結(jié)果.結(jié)果如圖3所示.

圖3 種子培養(yǎng)時間對發(fā)酵效價的影響Fig.3 The effect of seed incubating time on fermentation titer

由圖3可知：當(dāng)種子培養(yǎng)時間分別為24，48，56 h時，轉(zhuǎn)接后發(fā)酵液中的他克莫司質(zhì)量濃度均較低，這是由于種子培養(yǎng)時間過短時，種子活力不夠，而當(dāng)種子培養(yǎng)時間過長時，種子進入平臺期，此時種子活力差，狀態(tài)也不穩(wěn).當(dāng)種子培養(yǎng)至40 h時，轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，他克莫司的效價最高，此時的種子活性較高，狀態(tài)穩(wěn)，發(fā)酵水平和發(fā)酵液質(zhì)量提高.因此，最終選取40 h為最佳接種時間.

2.4 不同接種量對發(fā)酵結(jié)果的影響

種子液的接種量會影響菌體的延滯期：接種量大，則延滯期短，菌體生長迅速，降低了產(chǎn)物的產(chǎn)量；接種量小，延滯期長，菌體生長緩慢，同樣不利于產(chǎn)物的積累.因此需要考察接種量對效價的影響.將種齡為40 h的種子按不同接種量接至發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵實驗，考察不同接種量對發(fā)酵效價的影響.結(jié)果如圖4所示.

圖4 接種量對發(fā)酵效價的影響Fig.4 The effect of inoculation amount on fermentation titer

由圖4可知：當(dāng)接種量逐漸升高時，發(fā)酵的效價呈明顯下降的趨勢，這是因為接種量增大時，菌體生長速率較快，大量消耗發(fā)酵培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，導(dǎo)致用于代謝合成他克莫司的直接碳源大大減少，并且加劇了發(fā)酵液中副產(chǎn)物的積累.通過本實驗可知：當(dāng)接種量為10%時，發(fā)酵液中他克莫司的質(zhì)量濃度最高.

2.5 發(fā)酵過程放大的研究

由搖瓶發(fā)酵放大到發(fā)酵罐發(fā)酵時，各方面條件有所變化，特別是對發(fā)酵條件的控制，如溫度、溶解氧、pH值和裝液量等主要參數(shù)的控制方式與搖瓶不同，會造成發(fā)酵結(jié)果與搖瓶的差異性，因此進行放大研究，評估裝液量和溶氧等影響因素對發(fā)酵過程的影響.

2.5.1 裝液量對發(fā)酵結(jié)果的影響

他克莫司的發(fā)酵屬于好氧性發(fā)酵，在搖瓶發(fā)酵過程中，影響溶氧的因素主要是搖瓶的裝液量和搖床的轉(zhuǎn)數(shù).控制搖床的轉(zhuǎn)數(shù)為300 r/min，在500 mL搖瓶中測定不同裝液量對發(fā)酵結(jié)果的影響.結(jié)果如圖5所示.

圖5 裝液量對發(fā)酵效價的影響Fig.5 The effect of loading volume on fermentation titer

由圖5可知：500 mL搖瓶的裝液量為20 mL時，發(fā)酵液中他克莫司產(chǎn)量最高.這是因為在該裝液量下，溶氧較高，有利于他克莫司的積累，并減少了副產(chǎn)物的生成.從實驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn)裝液量是影響搖瓶發(fā)酵溶氧的重要因素.在發(fā)酵轉(zhuǎn)速一定時，裝液量越低，發(fā)酵液中的溶氧越高.但是在發(fā)酵過程中裝液量過低時，由于培養(yǎng)基水分蒸發(fā)等因素造成的發(fā)酵液體積變化較大，并且隨著菌體發(fā)酵代謝的不斷進行，發(fā)酵液中營養(yǎng)成分不足導(dǎo)致發(fā)酵過程中產(chǎn)他克莫司的水平下降.

2.5.2 溶氧對發(fā)酵結(jié)果的影響

在筑波鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)過程中，溶氧是影響發(fā)酵的關(guān)鍵因素，對微生物的生長和產(chǎn)物形成有重要的影響.要根據(jù)氧的溶解特性及微生物對氧的需求，分析溶氧對發(fā)酵的影響及對發(fā)酵產(chǎn)物的影響，進而確定溶氧量的控制及在發(fā)酵液中的傳遞，使生產(chǎn)效益最大化.筆者在20 t發(fā)酵罐中研究了10%，20%，30%溶氧對發(fā)酵產(chǎn)他克莫司產(chǎn)量的影響.結(jié)果如圖6所示.

圖6 溶氧對發(fā)酵效價的影響Fig.6 The effect of dissolved oxygen on fermentation titer

由圖6可知：發(fā)酵前期，溶氧高低對發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的影響較小，溶氧較低時發(fā)酵效價相對較低.當(dāng)溶氧超過20%時，他克莫司產(chǎn)量變化不明顯.此外，可以發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵后期溶氧高低對發(fā)酵結(jié)果影響不大，發(fā)酵效價處在一個穩(wěn)定的水平，這可能是因為發(fā)酵中后期，菌絲體對溶氧的要求不高.因此在發(fā)酵對數(shù)生長期可以提高溶氧，促使菌體生長和代謝，在發(fā)酵中后期可以考慮降低空氣供應(yīng)量，同時降低攪拌轉(zhuǎn)速，以此來節(jié)能降耗，降低成本.

2.5.3 分批補料發(fā)酵過程優(yōu)化

根據(jù)前期搖瓶補料實驗結(jié)果以及放大控制條件摸索，采用優(yōu)化后的工藝配方，進行20 t罐補料放大實驗，發(fā)酵過程中溶氧控制在20%以上，并在發(fā)酵中后期進行補料.結(jié)果如圖7所示.

圖7 分批補料發(fā)酵過程曲線Fig.7 Fermentation process curve of feed-batch

由圖7可知：補料工藝的他克莫司質(zhì)量濃度達(dá)到1 150 μg/mL，產(chǎn)量有大幅度提升.實驗發(fā)現(xiàn)只在發(fā)酵第4天進行補料，對他克莫司產(chǎn)量影響較小.而在發(fā)酵第4天和第5天連續(xù)補料時，產(chǎn)量明顯提高.這是由于在發(fā)酵中后期菌體消耗糖等速率快，生長達(dá)到最高值，并大量合成他克莫司，此時進行補料可以延緩菌體進入衰亡期，提高菌體的生產(chǎn)發(fā)酵能力.

2.6 提取與精制過程工業(yè)化研究

在微生物發(fā)酵液中，存在許多蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)，為后續(xù)產(chǎn)品的分離純化帶來了很大的難度.在他克莫司的發(fā)酵液中還存在很多異構(gòu)體和類似物，主要雜質(zhì)有二氫他克莫司、子囊霉素等，其中子囊霉素與他克莫司只相差1 個亞甲基，而二氫他克莫司與他克莫司相差2 個氫原子，因此子囊霉素、二氫他克莫司與他克莫司的結(jié)構(gòu)極為相似(相似度95%以上)，在溶劑中的溶解性和對溶劑的親和力相近，因為這些物質(zhì)的存在，常規(guī)的分離純化方法無法完全分離他克莫司，產(chǎn)品達(dá)不到相應(yīng)的純度，純化分離難度極大，生產(chǎn)工藝水平低，工藝成本居高不下.

2.6.1 提取工藝優(yōu)化

為了除去發(fā)酵液中的色素等雜質(zhì)，篩選了不同品種的活性炭(活性炭PT-A303，活性炭8815，PT303-1和白鷺-Z)，考察脫色效果和粗品質(zhì)量.結(jié)果如圖8所示.

圖8 脫色材料的選擇Fig.8 Selection of decolorizing materials

由圖8可知：活性炭PT-A303的脫色損失最小，而且經(jīng)該脫色材料脫色后的結(jié)晶收率最高，這說明該脫色材料既能較好地吸附色素，而且對產(chǎn)品的吸附較少.脫色后，用V(乙酸乙酯)∶V(正庚烷)∶V(純水)=1∶3∶2的結(jié)晶溶劑對脫色液進行濃縮結(jié)晶，30 ℃保溫1 h，冷卻至20 ℃，繼續(xù)攪拌2 h，過濾得到他克莫司粗品.

2.6.2 他克莫司層析技術(shù)

為了進一步提高產(chǎn)品質(zhì)量，提高提煉收率，并實現(xiàn)他克莫司中結(jié)構(gòu)類似雜質(zhì)子囊霉素(FK520)和8-丙基他克莫司(2H-FK506)的有效分離，開發(fā)了針對FK506分離純化的Q5親和層析工藝，利用這種材料具有選擇性吸附某個化合物或某類結(jié)構(gòu)相似的化合物的特點，高親和性及高選擇性分離目標(biāo)化合物.選擇親和層析填料上的配基與FK506分子結(jié)構(gòu)上的C36雙鍵形成配位鍵，而類似物FK520和2H-FK506分子結(jié)構(gòu)上C36無雙鍵基團，不能與本親和填料上的配基形成配位鍵，故本填料吸附FK506能力顯著大于類似物FK520和2H-FK506，從而達(dá)到徹底分離去除FK520及2H-FK506雜質(zhì)的目的，提高產(chǎn)品質(zhì)量及純化收率.以V(乙醇)∶V(乙酸乙酯)=45∶55的洗脫液洗脫分離FK520和2H-FK506雜質(zhì)，最終只需一次層析即可達(dá)到徹底分離去除FK520及2H-FK506的目的，收率達(dá)86.6%，他克莫司的純度達(dá)99.5%，F(xiàn)K520和2H-FK506雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.13%和0.2%.

3 結(jié) 論

通過研究不同發(fā)酵條件對他克莫司發(fā)酵的影響，獲得了最適搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件：種子培養(yǎng)基中以1.5 g/L葡萄糖為輔碳源，種子培養(yǎng)時間40 h，500 mL搖瓶裝液量為20 mL，接種量為10%；20 t發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)過程中溶氧控制在20%以上，發(fā)酵周期為7 d，發(fā)酵第4天和第5天進行分批補料，最終發(fā)酵得到他克莫司的質(zhì)量濃度為1 150 μg/mL.優(yōu)化了他克莫司發(fā)酵液的提取和精制工藝，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供了可靠的工業(yè)路線.粗提取時選擇活性炭PT-A303進行萃取后脫色處理，經(jīng)V(乙酸乙酯)∶V(正庚烷)∶V(純水)=1∶3∶2混合溶劑對脫色濃縮液進行結(jié)晶得到粗品.精制的過程中，采用Q5親和層析工藝，達(dá)到徹底分離去除FK520及2H-FK506等相似結(jié)構(gòu)雜質(zhì)的目的，收率達(dá)86.6%，他克莫司的純度達(dá)99.5%，F(xiàn)K520和2H-FK506雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.13%和0.2%.

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