趙玉巧,仲美榮,顧玲玲,類登昌

(淮海工學(xué)院海洋學(xué)院,江蘇連云港 222005)

海藻糖是由2個(gè)葡萄糖分子組成的1個(gè)非還原性雙糖[1],它有3種異構(gòu)體,分別是α、α-海藻糖、α、β-海藻糖和β,β-海藻糖,天然存在的異構(gòu)體是α,α型海藻糖[2],廣泛存在于各種生物體中,包括細(xì)菌、酵母、真菌和藻類以及一些昆蟲(chóng)、無(wú)脊椎動(dòng)物和植物中。它不僅是作為一種碳水化合物類的能源物質(zhì),還可防御如高溫、冷凍、脫水和高滲透壓等不利環(huán)境因素,該特性已被廣泛運(yùn)用于食品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)[3]。海藻糖的生產(chǎn)方法較多,有微生物抽提法、從發(fā)酵液中提取、酶轉(zhuǎn)化法和基因重組法[4],目前海藻糖的生產(chǎn)方法主要為從發(fā)酵液中提取和酶轉(zhuǎn)化法,由于海藻糖提取與純化步驟的復(fù)雜性,當(dāng)海藻糖的含量小于原料干重的15%時(shí)不適合產(chǎn)業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)[5]。本文研究從海洋中篩選出高產(chǎn)海藻糖菌株,并對(duì)菌株培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,以期降低海藻糖的生產(chǎn)成本,使菌株具有一定的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 從連云港近海海域采集的新鮮海水、海泥及海洋魚(yú)貝類中分離篩選產(chǎn)生海藻糖的菌株,并進(jìn)行編號(hào)。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①液體富集培養(yǎng)基：葡萄糖20 g,蛋白胨10 g,酵母膏5 g,KH2PO45g,MgSO4·7H2O 2 g,鏈霉素30 mg,補(bǔ)煮沸過(guò)濾陳海水至1 000 mL,pH 6.3～6.5;②平板富集培養(yǎng)基：蔗糖15 g,葡萄糖5 g,蛋白胨10 g,酵母膏5 g,KH2PO45 g,MgSO4·7H2O 2 g,鏈霉素30 mg,瓊脂20 g,補(bǔ)煮沸過(guò)濾陳海水至1 000 mL,pH 6.3～6.5;③PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g,蔗糖20 g,瓊脂20 g,補(bǔ)煮沸過(guò)濾陳海水至1 000 mL,pH自然;④發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖31 g,酵母膏9.9 g,蛋白胨9.9 g,NH4Cl 2.2 g,KH2PO40.4 g,Na2HPO40.4 g,MgSO40.2 g,CaCl20.2 g,FeCl30.2 g,補(bǔ)煮沸過(guò)濾陳海水至1 000 mL,pH 5.5。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌株的分離及產(chǎn)海藻糖菌株的初篩

海水樣品在5 000 r/min離心15 min得海水沉淀物(海泥取適量,海洋魚(yú)貝類取內(nèi)臟),接種到液體富集培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)條件為30℃,160 r/min 72 h。液體富集培養(yǎng)菌懸液在平板富集培養(yǎng)基上劃線分離單菌落,培養(yǎng)條件為30℃48 h。將分離得到的單菌落接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,于搖床中160 r/min,30℃培養(yǎng)60 h,用紙層析法確定產(chǎn)海藻糖酵母100余株,編號(hào)后保存在PDA斜面培養(yǎng)基上。

1.2.2 產(chǎn)海藻糖菌株的復(fù)篩 將斜面保存的菌種分別接種到發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中,在30℃,160 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h作為種子,在裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中按5%的接種量接入種子,在30℃,160 r/min的條件下,搖瓶培養(yǎng)60 h,取發(fā)酵液離心收集菌體測(cè)干重并測(cè)定海藻糖含量。

1.2.3 海藻糖產(chǎn)生菌2-14的形態(tài)特征及生理生化特征 對(duì)菌株進(jìn)行假菌絲、子囊孢子、擲孢子、糖發(fā)酵、碳源同化、氮源同化、DBB、尿酶等實(shí)驗(yàn)[6-7]。

1.2.4 細(xì)胞生長(zhǎng)量的測(cè)定 采用細(xì)胞干重法。

1.2.5 海藻糖的測(cè)定方法 ①紙層析法：展開(kāi)劑為正丁醇：丙酮：水：醋酸=l0：3：6：2(體積比),顯色劑A液：AgNO3的水-丙酮飽和溶液,水：丙酮=1：200(體積比);B液：將l gNaOH溶于100 g乙醇水溶液中,乙醇：水=1：1(質(zhì)量比)[8];②硫酸-蒽酮法：見(jiàn)參考文獻(xiàn)[9]。

1.2.6 發(fā)酵條件對(duì)海藻糖產(chǎn)生的影響 ①初始pH對(duì)紅酵母產(chǎn)海藻糖的影響：分別選擇初始pH 3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0,其他發(fā)酵條件為：溫度28℃,裝液量為250 mL三角瓶裝50 mL培養(yǎng)基,發(fā)酵時(shí)間60 h;②發(fā)酵溫度對(duì)紅酵母產(chǎn)海藻糖的影響：發(fā)酵溫度選擇22、25、28、30、37℃,初始pH 5.5,裝液量為250 mL三角瓶裝50 mL培養(yǎng)基,發(fā)酵時(shí)間60 h;③裝液量對(duì)紅酵母產(chǎn)海藻糖的影響：在250 mL三角瓶中裝液量分別為25、50、75、100、125 mL,發(fā)酵溫度28℃,初始pH5.5,發(fā)酵時(shí)間60 h;④菌體生長(zhǎng)及海藻糖產(chǎn)生曲線：在5 L小型發(fā)酵罐中裝3.5 L發(fā)酵培養(yǎng)基,恒28℃;pH 5.5左右,發(fā)酵時(shí)間60 h。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)海藻糖酵母的篩選結(jié)果

對(duì)180余份海水及海泥等樣品的初篩得到100余株產(chǎn)海藻糖菌株,對(duì)其中60余株海藻糖產(chǎn)量較高的菌株進(jìn)行復(fù)篩,其中10株產(chǎn)量高的菌株復(fù)篩結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 10株產(chǎn)海藻糖菌株搖瓶復(fù)篩結(jié)果Fig.1 The results of trehalose production from 10 strain

由圖1可見(jiàn),編號(hào)為2-14的菌株海藻糖含量最高,為127.9 mg/g cell,其次菌株3-12海藻糖含量為105.1 mg/g cell,這2株菌均有一定的應(yīng)用價(jià)值。

2.2 菌株2-14的鑒定

2.2.1 形態(tài)特征 由圖2可見(jiàn),菌株2-14細(xì)胞呈圓形或橢圓形,其大小約為5.1～7.2μm,繁殖方式為芽殖,無(wú)假菌絲、子囊孢子及擲孢子形成。發(fā)酵液清,表面無(wú)醭、無(wú)環(huán)、無(wú)氣泡、無(wú)沉淀。菌落飽滿潮濕,顏色為紅色,邊緣整齊,無(wú)褶皺。

圖2 菌株2-14的細(xì)胞形態(tài)Fig.2 The morphological character of strain 2-14

2.2.2 糖發(fā)酵試驗(yàn) 菌株2-14對(duì)乳糖、半乳糖、可溶性淀粉、L-山梨糖、D-木糖、D-果糖、L-鼠李糖、麥芽糖、海藻糖、甘露醇、核糖、葡萄糖、蔗糖、琥珀酸、檸檬酸均不發(fā)酵。

2.2.3 碳源同化試驗(yàn) 由于菌株2-14對(duì)糖、醇及酸均不發(fā)酵,選擇14種碳源進(jìn)行同化試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn),該菌株不同化淀粉、乳糖、山梨糖及琥珀酸。

表1 菌株2-14碳源同化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of strain 2-14 on differents carbon sources

2.2.4 氮源同化試驗(yàn)結(jié)果 由表2可見(jiàn),菌株2-14對(duì)所選擇的5種氮源均同化。

表2 菌株2-14氮源同化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of strain 2-14 on differents nitrogen sources

2.2.5 其他生理生化試驗(yàn) 菌株2-14不液化明膠,脲酶陽(yáng)性,葡萄糖氧化陰性,DBB陽(yáng)性,類淀粉化合物形成結(jié)果為陰性,石蕊牛奶試驗(yàn)產(chǎn)堿,在37℃條件下能正常生長(zhǎng)。根據(jù)菌株2-14的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及生理生化特征,該菌株與《酵母的特征與鑒定手冊(cè)》中紅酵母屬(Rhodotorula)的分類特征最相符,所以初步鑒定菌株2-14為紅酵母屬。

2.3 初始pH對(duì)紅酵母產(chǎn)海藻糖的影響

由圖3可見(jiàn),隨著初始pH的增大,紅酵母細(xì)胞中海藻糖產(chǎn)量快速增加,至初始pH 5.5時(shí)達(dá)到最高,當(dāng)初始pH大于5.5時(shí)紅酵母細(xì)胞中海藻糖產(chǎn)量則快速降低,紅酵母細(xì)胞干重受初始pH的影響結(jié)果與產(chǎn)海藻糖的結(jié)果一致。上述結(jié)果說(shuō)明該紅酵母生長(zhǎng)及海藻糖的積累均對(duì)初始pH敏感,在發(fā)酵過(guò)程中,應(yīng)該嚴(yán)格控制初始pH以及發(fā)酵過(guò)程pH。

圖3 pH對(duì)紅酵母海藻糖產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of pH on trehalose production

2.4 發(fā)酵溫度對(duì)紅酵母產(chǎn)海藻糖的影響

由圖4可以看出,隨著溫度的升高紅酵母細(xì)胞干重及海藻糖產(chǎn)量均較快增加,均在28℃達(dá)到最高,當(dāng)發(fā)酵溫度為37℃時(shí)紅酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)量仍較大,但該溫度下細(xì)胞中海藻糖產(chǎn)量下降較多。

圖4 溫度對(duì)紅酵母海藻糖產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of tempersture on trehalose production

2.5 裝液量對(duì)紅酵母產(chǎn)海藻糖的影響

由圖5可以看出,雖然紅酵母細(xì)胞干重及海藻糖產(chǎn)量的最高點(diǎn)均為裝液量75 mL(250 mL三角瓶中),但裝液量對(duì)該酵母生長(zhǎng)的影響不太大,對(duì)海藻糖的產(chǎn)生影響卻較明顯。采用優(yōu)化前發(fā)酵條件紅酵母海藻糖產(chǎn)量為132.1 mg/g cell,由圖5可知,裝液量75 mL時(shí)紅酵母海藻糖產(chǎn)量為193.3 mg/g cell,優(yōu)化后的結(jié)果是優(yōu)化前的1.46倍。

圖5 裝液量對(duì)紅酵母海藻糖產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect ofmedium on trehalose production

2.6 菌體生長(zhǎng)及海藻糖產(chǎn)生曲線

紅酵母在5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵,結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可見(jiàn),發(fā)酵時(shí)間20 h前培養(yǎng)基中蔗糖濃度快速降低,隨著蔗糖濃度的降低,細(xì)胞增殖較快并在20 h接近穩(wěn)定期,細(xì)胞中海藻糖在20 h前有一定量的積累但不多。發(fā)酵時(shí)間20 h后,隨著培養(yǎng)基中蔗糖的耗竭,細(xì)胞中海藻糖產(chǎn)量逐漸提高,至54 h達(dá)到最高,為190.3 mg/g cell,54 h后細(xì)胞中海藻糖產(chǎn)量快速下降,原因是培養(yǎng)基中蔗糖及其他成分的嚴(yán)重缺乏,使得細(xì)胞中的海藻糖水解酶開(kāi)始水解海藻糖以維持細(xì)胞的活力。54 h時(shí)發(fā)酵液中海藻糖含量為2.50 g/L,由圖5可知pH 5.5時(shí)搖瓶發(fā)酵液中海藻糖含量為1.52 g/L,發(fā)酵罐培養(yǎng)每升發(fā)酵液中海藻糖含量為搖瓶培養(yǎng)的1.6倍,確定54 h為最佳發(fā)酵時(shí)間。

圖6 紅藻酵母生長(zhǎng)和海藻糖積累曲線Fig.6 Progress curves of cell growth and trehalose production

3 討 論

由于大多數(shù)酵母在適當(dāng)?shù)臈l件下可產(chǎn)生海藻糖,故在篩選培養(yǎng)基中加入了鏈霉素,篩選出的菌株大多數(shù)為酵母,從其中產(chǎn)量較高的10株菌的海藻糖含量可以發(fā)現(xiàn),從海洋中篩選產(chǎn)量較高的海藻糖產(chǎn)生菌比較容易。

根據(jù)菌株2-14的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及生理生化特征,依據(jù)《酵母的特征與鑒定手冊(cè)》中有關(guān)酵母菌的分類特征,菌株2-14與紅酵母屬最相符,初步鑒定菌株2-14為紅酵母屬(Rhodotorula)。本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)的菌種分類鑒定方法,該方法工作量大,過(guò)程繁瑣,盡管部分試驗(yàn)多次重復(fù)但還是不能排除個(gè)別試驗(yàn)結(jié)果的誤差。

對(duì)紅酵母搖瓶發(fā)酵條件試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),該酵母生長(zhǎng)及海藻糖的積累均對(duì)初始pH敏感,原因可能是該紅酵母中海藻糖合成酶的最適pH范圍小,在pH 5.5附近。紅酵母發(fā)酵溫度高于28℃對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響不大,但對(duì)紅酵母產(chǎn)生海藻糖有較大的影響,可能與海藻糖對(duì)細(xì)胞的保護(hù)及海藻糖合成酶的最適溫度有關(guān)。紅酵母生長(zhǎng)及積累海藻糖的最佳裝液量均為75 mL(250 mL三角瓶中),說(shuō)明該酵母對(duì)氧的需要量適中,這與大多數(shù)酵母對(duì)氧需要量相似。在5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵的結(jié)果表明,該酵母在進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期后海藻糖開(kāi)始快速積累,特別是當(dāng)蔗糖耗竭時(shí)海藻糖增長(zhǎng)更快,說(shuō)明該酵母碳源缺乏后可刺激海藻糖的產(chǎn)生。在發(fā)酵罐中培養(yǎng)雖然細(xì)胞中海藻糖含量沒(méi)有提高,但細(xì)胞干重提高較多,達(dá)到13 g/L,而在搖瓶中細(xì)胞干重最高僅為8.6 g/L,可見(jiàn)在發(fā)酵罐中培養(yǎng)效果優(yōu)于搖瓶培養(yǎng)。

[1] Tarek El-Bashiti,Haluk Hamamci,Huseyin A.oktem,et al.Biochemical analysis of thehalose and its metabolizing enzymes in wheat under abiotic stress conditions[J].Plant Science,2005,169：47-54.

[2] Attilio Cesaro,Ornela De Giacomo,Fabiana Sussich.Water interplay in trehalose polymorphism[J].Food Chemistry,2008,106：1318-1328.

[3] Youn Jeung Cho,Oh Jin Park,Hyun Jae Shin. Immobilization of thermostable trehalose synthase for the production of trehalose[J].Enzyme andMicrobial Technology,2006,39：108-113.

[4] 趙曉峰,吳榮書(shū).海藻糖的功能特性及其應(yīng)用[J〗.廣州食品工業(yè)科技,2004,20(2)：151-154.

[5] Chiara Schiraldi,Isabella Di Lernia and Mario De Rosa.Trehalose Production：exploiting novel approaches[J].TRENDS in Biotechnology,2002,20(10)：420-425.

[6] 東秀珠,蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社,2001：364-387.

[7] J.A.巴尼特著,亞羅,胡瑞卿譯.酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)[M].青島：青島海洋大學(xué)出版社,1991：17-164.

[8] 王蘭,肖冬光.紙層析分離洗脫法定量測(cè)定海藻糖[J].生物技術(shù),2002,12(3)：27-29.

[9] 譚海剛,梅英杰,關(guān)鳳梅,等.蒽酮-硫酸法測(cè)定酵母中海藻糖的含量[J].現(xiàn)代食品科技,2005,22(1)：125-128.