辛?xí)阅?閆志勇,楊 麗,吳 瑤,王 斌,宋旭霞,羅 瑋

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院,山東青島 266070)

嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophom onas m alto-phila)屬黃單胞菌科寡養(yǎng)單胞菌屬,是一種需氧革蘭陰性桿菌,廣泛分布于水、土壤、植物根系、人和動物的體表與消化道中,具有很強(qiáng)的代謝活性及廣泛的適應(yīng)能力。近年來研究發(fā)現(xiàn),該菌能產(chǎn)生多種具有較高研究開發(fā)價(jià)值的生物活性物質(zhì),如蛋白酶、氧化酶、堿性磷酸酶、酪氨酸酶、纖溶酶、脂肪酶、淀粉酶等[1-2]。本實(shí)驗(yàn)室從海洋生物雙齒圍沙蠶消化道中分離出1株嗜麥芽寡氧單胞菌(D2株),前期研究結(jié)果顯示其具有顯著的蛋白酶活性和纖維蛋白溶解活性[3]。在分析構(gòu)建D2株基因組文庫時(shí)發(fā)現(xiàn),該菌株具有編碼單加氧酶(monooxgenase,MO)的基因片段。單加氧酶是一種在有機(jī)氧化反應(yīng)中起關(guān)鍵作用的生物催化劑,能有效地、特異地向有機(jī)底物中插入1個(gè)氧原子,具有反應(yīng)條件溫和、速度快、專一性強(qiáng)等特點(diǎn),在環(huán)保、工業(yè)等領(lǐng)域中具有重要作用[4]。本研究通過基因重組技術(shù)獲得了D2菌株單加氧酶的完整的編碼基因序列,構(gòu)建了融合表達(dá)載體,并成功進(jìn)行了原核表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株由本室閆志勇副教授分離自海洋生物雙齒圍沙蠶消化道,已被中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CG MCC)收藏,收藏號CG MCC 1868;pMD18-T購自大連寶生物工程有限公司;pET32a(+)、大腸埃希菌JM109、BL21(DE3)為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 ①試劑：細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、Taq酶購自Promega公司;DNA Marker、dNTPs購自TAKARA公司,質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)mega公司;X-gal、氨芐青霉素、IPTG購自Sigma公司;②儀器：基因擴(kuò)增儀購自德國Eppendorf公司;UVP GDS8000型凝膠成像系統(tǒng)購自美國UVP公司。

1.2 方法

1.2.1 D2菌株基因組DNA的提取 將D2接種于LB培養(yǎng)基,48 h后挑取單個(gè)菌落,接種于LB液體培養(yǎng)基,12 h至菌液OD600值約為0.6,參照Promega細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒的說明書提取基因組DNA。

1.2.2 D2株基因組文庫的構(gòu)建及部分克隆的分析 用Sau3A I酶切D2株基因組DNA,回收0.2～2 kb的DNA片段,連接至pUC18質(zhì)粒載體,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌JM109,在含有Amp的LB平板上篩選重組子,酶切鑒定后建庫保存;隨機(jī)挑取陽性克隆測序,在網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST分析。

1.2.3 PCR擴(kuò)增單加氧酶全基因序列 經(jīng)對D2株基因組文庫中部分克隆的分析發(fā)現(xiàn),有一克隆序列與GenBank中嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌R551-3和K279a單加氧酶基因具有較高的同源性,為單加氧酶基因的部分基因片段。為獲得該菌的全基因序列,將上述2株細(xì)菌的單加氧酶基因用DNA Star軟件進(jìn)行分析,根據(jù)保守區(qū)序列使用設(shè)計(jì)引物：For ward：5′-GATCGGCGAGCAGGACCAGT-3′,Reverse：5′-AGTTCTACATCGACATCGCGCGT-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物長度約1 300 bp,由上海Invitrogen公司合成。在100μL體系中分別加入模板DNA 1.0μL,dNTPs 10μL,MgCl24.0μL,上下游引物各4.0μL,TaqDNA聚合酶1.5μL;PCR的循環(huán)條件為94℃變性5 min,然后94℃1 min、56℃1 min、72℃1 min,30個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。PCR結(jié)束后取將產(chǎn)物1.2%的瓊脂糖凝膠電泳,用UVP GDS8000型凝膠成相系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.2.4 單加氧酶基因的克隆和序列測定 使用Promega公司W(wǎng) izard PCR preps DNA purificaton system試劑盒純化PCR產(chǎn)物。純化后的產(chǎn)物按常規(guī)方法與pMD18-T于4℃過夜后連接,TSS法制備大腸埃希菌JM109感受態(tài)并轉(zhuǎn)化,藍(lán)白斑篩選陽性克隆,Omega公司質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒,EcoR I酶切鑒定。將經(jīng)過酶切鑒定的含陽性克隆的菌液送上海Invitrogen公司用AB I3730自動測序儀測序。

1.2.5 D2株單加氧酶基因的體外原核表達(dá)克隆的構(gòu)建和表達(dá) ①引物的設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增：根據(jù)1.2.3獲得的基因序列,找出單加氧酶基因的ORF,并設(shè)計(jì)表達(dá)擴(kuò)增引物,Forward：5′-CG ggatcc ATGAGCTATCAGATCAGCGTC-3′,Reverse：5′-TAT aagctttCAGGCCACCGCCGCG-3′,下劃線部分分別為BamHⅠ和HindⅢ的酶切識別位點(diǎn),產(chǎn)物長度996 bp。以重質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增;②表達(dá)克隆的構(gòu)建和鑒定：使用Promega公司的試劑盒純化PCR產(chǎn)物,將該回收產(chǎn)物及pET-32a(+)分別用B amHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切,凝膠電泳后用Omega公司Cycle-Pure kit試劑盒純化回收酶切產(chǎn)物。將回收的目的基因片段和表達(dá)載體pET32a(+)片段用T4連接酶于16℃過夜鏈接,然后TSS法轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21,在ALB平板上挑選重組克隆,提取質(zhì)粒后用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定;③目的基因的表達(dá)：挑取酶切鑒定正確的重組子,用ALB液體培養(yǎng)基37℃過夜培養(yǎng)至OD600值為0.8時(shí),1：100接種入新的ALB液體培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)至OD600值約為0.8后,加入終濃度為1 mmol/L的IPTG,37℃誘導(dǎo)5 h,取菌液沉淀SDSPAGE電泳觀察表達(dá)蛋白。

2 結(jié) 果

2.1 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株單加氧酶基因的序列測定

以嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株的基因組DNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得了包含嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株單加氧酶編碼基因在內(nèi)的約1 300 bp的產(chǎn)物,見圖1,將其連接到pMD18,挑選重組載體EcoRⅠ酶切鑒定,見圖2,經(jīng)鑒定證實(shí)后的重組基因測序,獲得了長度為1 327 bp的基因序列信息(GenBank收錄號GQ122330)。

圖1 包含編碼基因在內(nèi)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 the amplified product by polymerase chain reaction including coding gene

2.2 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株單加氧酶基因表達(dá)克隆的構(gòu)建與鑒定

對2.1的測序結(jié)果進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其中包含了1個(gè)長度996 bp的完整ORF,根據(jù)其序列設(shè)計(jì)引物,以重組pMD18為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得了嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株單加氧酶編碼基因完整的編碼基因,見圖3。將該基因片段連接到表達(dá)載體pET32a(+)中,重組克隆pET32a/MO經(jīng)B amHⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定證實(shí),見圖4。

經(jīng)PubMed中分析發(fā)現(xiàn),D2株單加氧酶與GenBanK中收錄的S.m altophiliaR551-3(GI 194346582)及S.m altophiliaK279a(GI1900100-13)相比,ORF基因序列的同源性分別為90%和89%,而氨基酸序列同源性高達(dá)96%和95%;且該氨基酸中含有flavin-utilizing monooxygenase超家族的共同保守區(qū)。

2.3 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株單加氧酶基因的體外原核表達(dá)

重組pET32a/MO轉(zhuǎn)化宿主菌BL21后,經(jīng)過IPTG誘導(dǎo),表達(dá)出大小約54 ku的融合目的蛋白,與設(shè)計(jì)相符,見圖5。

圖5 重組pET32a/MO在宿主菌BL21中的表達(dá)Fig.5 Expression of the recombined vector pET32a/MO inE.coliBL21

3 討 論

嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌廣泛分布于人體內(nèi)和外界環(huán)境中,因其既能導(dǎo)致人或動植物疾病,又可分泌多種生物活性物質(zhì),因而近年來引起廣泛關(guān)注。2008年分離自醫(yī)院感染的腫瘤病人血液的該菌K279株[5]和植物毛果楊(Populus trichocarpa)中的R551株[6]的全基因序列測序先后完成;對上述2株細(xì)菌的全基因組序列進(jìn)行了系統(tǒng)的比較,發(fā)現(xiàn)該菌具有許多基因組島(genomic islands,GEIs),其編碼蛋白與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的天然耐藥、生物活性物質(zhì)的合成和分泌有關(guān)[7]。

海洋中蘊(yùn)含豐富的微生物資源,其中包含了非常有研究價(jià)值的海洋微生物基因信息,“海洋生物基因組計(jì)劃”項(xiàng)目成為世界各海洋大國的焦點(diǎn),目的在于通過獲得相應(yīng)的遺傳序列,全面尋找有價(jià)值的遺傳信息,更有效地開發(fā)和應(yīng)用海洋微生物等資源。嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株是本實(shí)驗(yàn)室自2003年從生活于海岸潮間帶的海洋生物雙齒圍沙蠶消化道內(nèi)分離出的一種海洋微生物,能分泌產(chǎn)生許多胞外的生物活性物質(zhì)[8];在對構(gòu)建的D2株基因組文庫分析時(shí),發(fā)現(xiàn)一克隆的基因序列與K279株和R551株熒光素樣單加氧酶基因序列有較高的同源性。

單加氧酶是將單個(gè)氧原子加入到一個(gè)有機(jī)化合物分子中的一類酶,能使非反應(yīng)烴轉(zhuǎn)化為可利用烴,把烷烴轉(zhuǎn)化為醇或脂肪酸,把烯烴轉(zhuǎn)化為環(huán)氧化物,使芳香烴開環(huán)[5],高度特異性催化作用是其最顯著特征。單加氧酶具有降解體內(nèi)潛在的毒性化合物,合成次級代謝物、激素、信號分子等生理作用;此外,因其具有選擇性生物氧化的特性,某些單加氧酶能參與藥物之間的相互作用而被用于新藥的開發(fā)和研制,而有的則能應(yīng)用于降解工業(yè)環(huán)境中有害的有機(jī)物。由此可見,單加氧酶在環(huán)境保護(hù)、藥物研制等方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。然而,對于熒光素樣單加氧酶的酶學(xué)特征和生物學(xué)功能目前尚未見報(bào)道。

本文根據(jù)GenBank收錄的單加氧酶全基因序列設(shè)計(jì)引物,從D2基因組DNA中擴(kuò)增出包含該單加氧酶完整開放讀碼框(ORF)的核酸片段,并將該ORF亞克隆到pET32a中,最終成功地在體外原核系統(tǒng)中表達(dá)出了單加氧酶的融合蛋白,為將來進(jìn)一步研究該熒光素樣單加氧酶的生物學(xué)功能、結(jié)構(gòu)等奠定了基礎(chǔ);同時(shí),本文也再次證實(shí)D2菌株具有產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)的能力,豐富了海洋微生物基因信息。

[1] Tachibana S,Naka N,Kawai F,et al.Purification and characterization of cytoplasmic NAD-dependentpoly propylene glycol dehydrogenase from Stenotrophom onas maltophilia[J].FEMS Microbiol Lett.,2008,288(2)：266-272.

[2] Miyaji T,Otta Y,Shibata T,et al.Purification and characterization of extracellular alkaline serine protease from Stenotrophomonasmaltophilia strain S-1[J].Lett Appl Microbiol,2005,41(3)：253-257.

[3] 代玉梅,閆志勇,王斌,等.沙蠶消化道產(chǎn)蛋白酶菌D2株的篩選及其酶學(xué)性質(zhì)[J].中國生物制品學(xué)雜志,2007,20(10)：493-496.

[4] 周世水,姚汝華.海洋微生物天然活性物質(zhì)的開發(fā)應(yīng)用進(jìn)展[J].微生物學(xué)雜志,2002,22(2)：42-43.

[5] Crossman LC,Gould VC,Dow JM,et al.The complete genome,comparative and functional analysis of Stenotrophomonas maltophilia reveals an organism heavily shielded by drug resistance deter minants.Genome Biol.2008.9：R74.Azerad,R.(1999)Microbialmodels for drugmetabolis m.Adv.Biochem.Eng[J].Biotechnol,63,169-218.

[6] Lucas S,CopelandA,LapidusA,et al.Complete sequence of Stenotrophomonas maltophilia R551-3.EMBL/GenBank/DDBJ databases,Submitted JUN-2008.

[7] Francesco R,Eliana DG,Bianca C,et al.Stenotrophomonas maltophilia genomes：A start-up comparison[J].International Journal of Medical Microbiology,2009,299：535-546.

[8] L.Hauben,L.Vauteri,E.R.B.Moore,et al.Genomic diversity of the genus Stenotrophomonas[J].International Journal of Systematic Bacteriology,1999,49：1749-1760.