黃玖利,戴好富,王 輝,郁 蕾,梅文莉

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物技術(shù)重點開放實驗室,海南?？?571101)

海南粗榧(Cephalotaxus hainanensisLi)為三尖杉科(Cephalotaxaceae)三尖杉屬(Cephalotaxus)植物[1]。該植物因含有已被開發(fā)成治療白血病的臨床藥物高三尖杉酯堿和三尖杉酯堿而倍受關(guān)注[2]。但因其生長緩慢,加之過度采伐,目前數(shù)量稀少,已被列為國家二級保護植物。近年來,植物內(nèi)生菌研究的迅速發(fā)展不僅使人們認清內(nèi)生真菌在生態(tài)系統(tǒng)中的重要地位,更讓人們認識到它是一種重要的藥用生物資源。前人已從植物內(nèi)生真菌中分離得到生物堿、甾體、萜類、醌類和木脂素等多種類型化合物,并多具有抗腫瘤、抗菌、促進宿主植物生長、生物防治等生物活性,在醫(yī)藥業(yè)和農(nóng)業(yè)中有巨大的應(yīng)用潛力。本研究組從海南粗榧韌皮部分離出S15菌株,在生物活性篩選過程中,發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液提取物對胃癌細胞顯示出強細胞毒活性[3]。對該菌株擴大發(fā)酵,從其代謝產(chǎn)物中分離得到2個具有細胞毒活性的化合物,通過波譜方法鑒定其結(jié)構(gòu)為去乙酰基細胞松弛素D(Zygosporin D,1)和細胞松弛素D(Cytochalasin D,2)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 內(nèi)生真菌 菌種S15分離自海南粗榧韌皮部,暫被歸為無孢菌群[4],菌種保藏于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所。

1.1.2 腫瘤細胞株 MMC-7721(人肝癌細胞)、SGC-7901(人胃癌細胞)和K562(慢性髓原白血病細胞)均購于中科院上海生命科學(xué)研究院細胞庫。

1.1.3 臨床病原菌 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 51650、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)ATCC 9551由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所洪葵教授提供。

1.1.4 培養(yǎng)基 ①馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)：馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,定容至1 L,pH自然;②馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,定容至1 L,pH自然;③燕麥培養(yǎng)基：燕麥片30 g,瓊脂20 g,定容至1 L,pH自然;④玉米培養(yǎng)基：玉米粉300 g,瓊脂20 g,定容至1 L,pH自然;⑤牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(NA)：牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,定容至1 L,pH 7.4～7.6;⑥腫瘤細胞株采用RPM I1640完全培養(yǎng)基。

1.1.5 試劑 乙酸乙酯、氯仿、甲醇、丙酮、石油醚,均為分析純;碘化鉍鉀、硅膠、GF254薄層層析板和柱層析、200-300目硅膠(青島海洋化工廠)、Sephadex LH-20(Merck公司)。

1.1.6 儀器 重慶光電BK2301顯微鏡,Heidolph Laborota-20L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,Bruker AV-400核磁共振波譜儀(T MS內(nèi)標),Autospec-300質(zhì)譜儀。

1.2 方法

1.2.1 菌株S15形態(tài)觀察 將斜面保存的菌株S15經(jīng)PDA培養(yǎng)基活化,用滅菌打孔器(Φ=4.5 mm)取菌齡一致的菌絲塊,接種在PDA培養(yǎng)基平板中央,置于25℃恒溫箱中培養(yǎng),培養(yǎng)7 d后,測量并記錄直徑。將菌絲塊接種在PDA、燕麥、玉米培養(yǎng)基上,14 d后觀察產(chǎn)孢情況。

1.2.2 提取與分離 將斜面保存的菌株S15經(jīng)PDA培養(yǎng)基活化后接種于30 L PDB培養(yǎng)基中,25℃靜置培養(yǎng)30 d。發(fā)酵產(chǎn)物用雙層紗布過濾,發(fā)酵液經(jīng)減壓濃縮至2 L,用乙酸乙酯萃取3次,萃取液減壓濃縮后得乙酸乙酯萃取物9.5 g。乙酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠柱色譜以氯仿-甲醇(體積比20：1和10：1)梯度洗脫得14個流分(Fr.1～Fr.14),Fr.8經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜以氯仿-甲醇(體積比1：1)洗脫得化合物1(830 mg),Fr.9經(jīng)硅膠柱色譜以石油醚-丙酮(5：1)洗脫后再經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜以氯仿-甲醇(體積比1：1)洗脫得化合物2(26 mg)。

1.2.3 結(jié)構(gòu)鑒定 所分離到的純化合物用Autospec-300質(zhì)譜儀測定分子量,用BrukerAV-400核磁共振波譜儀(T MS內(nèi)標)測定NMR數(shù)據(jù)。

1.2.4 化合物活性測試 ①抗腫瘤活性測定：以S MMC-7721、SGC-7901和K562細胞為指示瘤株,待測化合物1 mg溶于100μL DMSO,采用MTT[5]法測定體外細胞毒活性。選取對數(shù)生長期的細胞,用RPM I1640完全培養(yǎng)基制成單細胞懸浮液,血球計數(shù)板計數(shù),按50 000個/mL接種90 μL于96孔平底細胞培養(yǎng)板,K562中直接加樣品10μL,S MMC-7721和SGC-7901經(jīng)培養(yǎng)24 h后,再加入樣品10μL;以DMSO為陰性對照,絲裂霉素C為陽性對照,培養(yǎng)條件為5%CO2、濕度90%以上、溫度37℃,加入樣品后繼續(xù)培養(yǎng)72 h,完成培養(yǎng)后取出,置于顯微鏡下觀察每孔細胞形態(tài)。然后加入5 mg/mL的MTT溶液15μL,37℃反應(yīng)4 h后,吸棄上清,再向各孔加入100μL DMSO,充分溶解,用ELX-800酶標儀測量各孔的OD值(測量波長為490 nm),按下式計算抑制率,并求出I C50值。

②抗臨床病原菌活性測定：采用濾紙片法[6]測定樣品抗菌活性。S.aureus和MRSA采用NA培養(yǎng)基培養(yǎng)。將S.aureus和MRSA分別制成一定濃度的菌懸液(105～107cfu/mL),用棉簽將其均勻涂布于供試無菌平板,制成含菌平板,待測化合物和陽性對照卡拉霉素濃度均為20μg/μL,待試樣品25μL用滅菌濾紙片(Φ=8 mm)吸附后揮干,制成含樣濾紙片,每個平板放置4個,每處理重復(fù)3次,空白濾紙片為陰性對照,S.aureus和MRSA 37℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果,測量并記錄抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株S15形態(tài)觀察

S15菌落白色,疏松,表面絨毛狀,與培養(yǎng)基結(jié)合較緊密,在PDA培養(yǎng)基上25℃生長7 d后平均直徑為42.7 mm。菌絲無色,長短、粗細不等,單個或數(shù)個相連,菌絲不分枝。壁平直、直徑約為3～7μm。部分菌絲較細,直徑約為1.5～3.5 μm,彎曲。在PDA、燕麥、玉米培養(yǎng)基上均不產(chǎn)孢。

圖1 S15的菌落形態(tài)Fig.1 The colony of S15

圖2 S15的菌絲形態(tài)(400×)Fig.2 The mycelia of S15(400×)

2.2 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

2.2.1 化合物1 白色晶體(丙酮),體積分數(shù)10%的硫酸顯棕黃色。碘化鉍鉀顯色呈橙黃色,推測其為生物堿或含有N原子。EI-MS∶m/z 465[M]+,結(jié)合13C NMR(DEPT)譜和1H NMR譜推定其分子式為C28H35NO5。1H NMR譜部分數(shù)據(jù)見表1,13C NMR譜數(shù)據(jù)見表2。

表1 化合物1(400 M Hz,Acetone-d6)和2的氫譜數(shù)據(jù)(400 M Hz,CDCl3)Table 1 1H NMR spectral data for compounds 1(400 MHz,Acetone-d6)and 2(400 MHz,CDCl3)

化合物1的各種波譜數(shù)據(jù)與文獻[7]報道的去乙酰基細胞松弛素D(Zygosporin D)的數(shù)據(jù)比較基本一致,基于上述分析,鑒定該化合物為去乙?；毎沙谒谼(Zygosporin D),其結(jié)構(gòu)式見圖3。

2.2.2 化合物2 白色晶體(氯仿),體積分數(shù)10%的硫酸顯棕黃色,碘化鉍鉀顯色呈橙黃色,推測其為生物堿或含有N原子。EI-MS：m/z507[M]+,結(jié)合13C NMR(DEPT)譜和1H NMR譜推定其分子式為C30H37NO6。1H NMR譜部分數(shù)據(jù)見表1,13C NMR譜數(shù)據(jù)見表2。該化合物各種波譜數(shù)據(jù)與文獻[8]報道的細胞松弛素D的數(shù)據(jù)比較基本一致,基于上述分析,鑒定該化合物為細胞松弛素D(Cytochalasin D),其結(jié)構(gòu)式見圖3。

圖3 化合物1和2的結(jié)構(gòu)Fig.3 Structures of compounds 1 and 2

表2 化合物1(100 M Hz,Acetone-d6)和2的碳譜數(shù)據(jù)(100 M Hz,CDCl3)Table 2 13C NMR spectral data of compounds 1(100 MHz,Acetone-d6)and 2(100 MHz,CDCl3)

2.3 生物活性測試

2.3.1 抗腫瘤活性測試 采用MTT法對2個化合物的抗腫瘤活性進行測試,結(jié)果顯示2種細胞松弛素對K562、S MMC-7721無細胞毒活性,對SGC-7901有細胞毒活性,其I C50值見表3。

2.3.2 抗臨床病原菌活性測定 采用濾紙片法測定了2種化合物抗臨床病原菌活性,結(jié)果表明2種細胞松弛素對S.aureus和MRSA均無抑菌活性。

表3 化合物1和2的細胞毒活性Table 3 The cytotoxic activities of compounds 1 and 2

3 討 論

細胞松弛素類化合物是一類由真菌代謝產(chǎn)生的毒素,已從長蠕孢屬(Helm inthosporiumsp.)、座堅殼屬(Roselliniasp.)、曲霉屬(Aspergillus sp.)、基點屬(Phom asp.)、擬莖點霉屬(Phom opsissp.)、毛殼菌屬[9](Chaetom iumsp.)、肉球菌屬[8](Englerom ycessp.)、接菌孢屬[10](Zygosporiumsp.)、綠僵菌屬[11](M etarrhiziumsp.)、鹿角菌屬[12](Xylariasp.)、炭團菌屬[13](Hypoxylon sp.)、輪層炭殼屬[14](Daldiniasp.)、鞘孢屬[15](Chalarasp.)和絲核菌屬[16](Rhizoctoniasp.)等真菌中分離得到,它們中有一些具有顯著的生物學(xué)活性,如抑制哺乳動物細胞分裂、抑制H IV-1蛋白酶、抗菌和抗腫瘤等活性。細胞松弛素因為具有改變細胞微結(jié)構(gòu)的作用,因此成為細胞生物學(xué)中細胞微結(jié)構(gòu)和功能研究的常用工具,用于探討細胞分裂、細胞運動和吞噬、細胞核和質(zhì)的關(guān)系和細胞生物合成等生命活動。

細胞松弛素D最早由英國學(xué)者Aldridge等于1969年從綠僵菌屬(M etarrhiziumsp.)分離得到并鑒定,后又從肉球菌屬(Englerom ycessp.)及鹿角菌屬(Xylariasp.)分離得到。去乙?；毎沙谒谼最早由日本學(xué)者Minato于1970年從接柄孢屬(Zygosporiumsp.)分離得到并鑒定,后又分別從肉球菌屬(Englerom ycessp.)及綠僵菌屬(M etarrhiziumsp.)分離得到。本研究從海南粗榧內(nèi)生真菌S15中同時分離得到細胞松弛素D和去乙?；毎沙谒谼,2種細胞松弛素對人胃癌細胞(SGC-7901)均有強細胞毒活性,其作用機理還有待進一步研究,但2種細胞松弛素對臨床病原細菌S.aureus和MRSA的生長均無抑制作用。

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