薛 清,段春梅,王玲娜,林雁冰＊

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,陜西楊凌 712100;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,陜西楊凌 712100 3.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西楊凌 712100;)

放線菌是一類產(chǎn)生豐富生物活性物質(zhì)的重要微生物資源。放線菌是新的生物活性物質(zhì)的主要產(chǎn)生菌,放線菌資源研究對抗生素工業(yè)發(fā)展有重要影響。今天隨著放線菌生物多樣性研究的進(jìn)展,放線菌仍然具有產(chǎn)生新的生物活性物質(zhì)的極大潛力[1]。研究資料顯示,目前已分離出的放線菌僅占其自然界存在總量的10%～20%,大多數(shù)放線菌由于多種原因不能在人工培養(yǎng)基上生長。要分離到更多的新放線菌類群,需要探索新的分離方法。目前,國內(nèi)外在放線菌分離方法研究方面已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展[2-8],研究發(fā)現(xiàn),采用多種物理、化學(xué)刺激以及改變培養(yǎng)基成分等措施[9-12],能有效提高稀有放線菌的出菌率,并分離出放線菌的新種屬[13-15]。微波是一種振蕩頻率為每秒24.5億次高頻電磁波。微波的加熱與殺菌作用已有大量研究,微波對生物體可以產(chǎn)生熱效應(yīng)、電效應(yīng)、磁效應(yīng)及化學(xué)效應(yīng)等,從而引起生物細(xì)胞多種生理生化變化或致死效應(yīng)[16]。從物理學(xué)和生物學(xué)原理推知,低強(qiáng)度微波輻射有可能消除抑制放線菌孢子萌發(fā)的某些制約因素,使部分不可培養(yǎng)放線菌的孢子萌發(fā),增加可培養(yǎng)放線菌的種類與數(shù)量。楊斌等[17]研究了微波處理不同有機(jī)質(zhì)含量沙質(zhì)土壤引起的放線菌數(shù)量變化,發(fā)現(xiàn)微波處理可以顯著增加放線菌的出菌率和拮抗性放線菌比例,但對鈣質(zhì)土壤及培養(yǎng)基加鈣后微波的處理效應(yīng)尚不清楚。本文重點(diǎn)探索中強(qiáng)度微波預(yù)處理對鈣質(zhì)土壤和培養(yǎng)基加CaCl2后土壤放線菌數(shù)量的影響,旨在為改善放線菌分離效果的微波預(yù)處理技術(shù)研究提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 供試土壤為栗鈣土,碳酸鈣含量為29.7～40.7 g/kg,采自內(nèi)蒙古自治區(qū)太仆寺旗寶昌鎮(zhèn)永勝村西芹田。其中,1～3號土樣為風(fēng)干土樣,4號土樣為4℃冰箱保存的濕土樣。土壤pH用DELTA 320pH計(jì)測定,有機(jī)質(zhì)用重鉻酸鉀氧化-外加熱法測定,碳酸鈣用鹽酸氣量法測定[18]。土壤化學(xué)性質(zhì)見表1。

表1 供試土壤化學(xué)性質(zhì)Table 1 The chemical properties of the soil tested

1.1.2 培養(yǎng)基 放線菌分離培養(yǎng)基：高氏1號培養(yǎng)基(GA)[19];高氏1號加鈣培養(yǎng)基(GA-Ca),即高氏1號培養(yǎng)基加入5 g/L的CaCl2;腐植酸瓊脂培養(yǎng)基HA[20]。以上培養(yǎng)基均在滅菌后加入滅菌的濃度為8 g/L的K2Cr2O7至80μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)方案 試驗(yàn)設(shè)2個(gè)處理：對照土樣(CK)：不進(jìn)行微波輻照;微波處理(Microwave Irradiation,M I)：120W功率模式下微波輻照3 min。1.2.2 土壤預(yù)處理 1～3號土樣在自然狀態(tài)下風(fēng)干;4號土樣為濕土,4℃冰箱保藏。試驗(yàn)前將1～3號風(fēng)干稱5.0 g碾磨至細(xì)粉的土樣,加95 mL無菌水制成懸液;4號濕土樣直接稱5.0 g加95 mL無菌水制成懸液,同時(shí)測定土壤含水量,用于計(jì)算干土含菌量。微波處理：稱取磨細(xì)的1～3號干土和4號濕土各5.0 g置于10 mL塑料離心管中,加入3 mL無菌水濕潤(使土壤能夠吸收微波);離心管放置于裝有500 mL、24℃自來水的水浴中(避免待處理土壤樣品因溫度升高產(chǎn)生溫度效應(yīng)),將放置土壤樣品的水浴置于微波爐內(nèi),以功率120 W模式處理3 min,再用滅菌針管吸取無菌水沖洗土樣,轉(zhuǎn)入裝有92 mL無菌水的三角瓶中,震蕩15 min分離測數(shù)。

1.2.3 放線菌分離計(jì)數(shù)及初步鑒定 將處理好的土壤懸液用10倍稀釋法稀釋,充分混勻后分別吸取0.1 mL滴加于GA、GA-Ca及HA平板上,重復(fù)3次。涂布均勻后在28℃下倒置培養(yǎng)10 d,計(jì)數(shù),并據(jù)菌落形態(tài)特征將具有鏈霉菌和小單孢菌菌落特征的放線菌暫定為“鏈霉菌屬”和“小單孢菌屬”,其余放線菌皆歸入“未鑒定屬”。同時(shí)挑取放線菌單菌落于高氏1號斜面中培養(yǎng)保存。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與結(jié)果計(jì)算 微波處理土壤放線菌數(shù)量與對照的相對差異用微波效應(yīng)EM I表示,計(jì)算公式如下：

式中Nm、Nck及EM I分別為微波處理、對照CK的放線菌數(shù)量及微波效應(yīng)。

試驗(yàn)結(jié)果顯著性分析采用DPS 9.50數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(T-檢驗(yàn))。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波對放線菌數(shù)量的影響

2.1.1 GA培養(yǎng)基 從表2可以看出,就GA培養(yǎng)基而言,微波處理能夠提高放線菌出菌率。其中,供試土樣放線菌總數(shù)較對照增加99.5%～234.1%,均達(dá)到極顯著水平(P＜0.01);鏈霉菌較對照增加58.3%～377.7%,除3號土樣外均達(dá)到極顯著水平;對小單孢菌而言,1～3號干土增加94.7%～651.4%,其中2、3號土樣微波處理與對照的差異達(dá)到顯著水平(P＜0.05),4號濕土較對照減少4.4%,與對照差異不顯著;未鑒定屬放線菌較對照增加96.7%～304.8%,均達(dá)到顯著(P＜0.05)或極顯著水平(P＜0.01)。

表2 微波處理后高氏1號培養(yǎng)基上放線菌的分離數(shù)量(105cfu/g)Table 2 The quantity of actinomycetes isolated from the medium of GA aftermicrowave irradiation(105cfu/g)

2.1.2 GA-Ca培養(yǎng)基 微波處理后GA-Ca培養(yǎng)基上放線菌出菌率也有不同程度增加,見表3。其中放線菌總數(shù)較對照增加8.8%～180.6%,均達(dá)到極顯著(P＜0.01)或顯著水平(P＜0.05);鏈霉菌總數(shù)較對照增加17.7%～151.3%,其中2號和3號土樣達(dá)到極顯著水平(P＜0.01);小單孢菌增加2.3%～420.0%,其中2號和3號土樣達(dá)到顯著水平(P＜0.05);未鑒定屬增加8.8%～234.5%,除4號土外,其余土壤樣品均達(dá)顯著(P＜0.05)或極顯著水平(P＜0.01)。

表3 微波處理后GA-Ca培養(yǎng)基上的放線菌數(shù)量(105cfu/g)Table 3 The quantity of actinomycetes isolated from the medium of GA-Ca aftermicrowave irradiation(105cfu/g)

2.1.3 HA培養(yǎng)基 HA培養(yǎng)基為鏈霉菌的選擇性培養(yǎng)基。微波處理后,HA培養(yǎng)基上鏈霉菌分離數(shù)量增加顯著,見表4。4種土樣較對照增長79.0%～126.0%,均達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)。說明微波處理能夠顯著增加HA培養(yǎng)基上鏈霉菌的數(shù)量。

表4 微波處理后腐植酸培養(yǎng)基上鏈霉菌分離數(shù)量(105cfu/g)Table 4 The quantity ofStreptomycetesisolated from the medium of HA aftermicrowave irradiation(105cfu/g)

由以上分析可看出,采用低強(qiáng)度微波對土壤進(jìn)行預(yù)處理可以增加放線菌的出菌率,大多數(shù)土樣的處理效應(yīng)達(dá)到顯著或極顯著水平,在3種培養(yǎng)基上的結(jié)果表現(xiàn)出基本相同的趨勢。

2.2 不同培養(yǎng)基上的微波效應(yīng)

從圖1可以看出,在不同培養(yǎng)基上EM I不同,其變化呈現(xiàn)出基本相同的趨勢：對放線菌總數(shù)、未鑒定屬放線菌及2號和3號土樣的小單孢菌數(shù)量而言,EM I均表現(xiàn)為GA＞GA-Ca;對鏈霉菌數(shù)量表現(xiàn)為GA＞HA＞GA-Ca。微波處理后,GA培養(yǎng)基上放線菌總數(shù)的EM I最大,GA上4個(gè)土樣處理后的EM I分別較GA-Ca培養(yǎng)基上處理后提高77.1%、120.9%、26.4%及90.7%;GA培養(yǎng)基上1、2、4號土壤鏈霉菌數(shù)量的EM I分別較HA培養(yǎng)基上鏈霉菌數(shù)量的EM I提高173.6%、139.8%、75.3%,即培養(yǎng)基成分影響微波效應(yīng)。

2.3 土樣含水量對微波效應(yīng)的影響

從圖1中1～3號干土與4號濕土(含水量415 g/kg)的微波增率對比可以看出,微波處理后濕土中放線菌總數(shù)、未鑒定放線菌數(shù)量的EM I均小于1～3號干土,其中4號土GA上放線菌總數(shù)的EM I較1～3號土樣分別減少134.6%、201.9%、65.9%;在GA-Ca培養(yǎng)基上放線菌總數(shù)的EM I分別減少148.16%、171.7%、130.2%;除3號土的在GA培養(yǎng)基上的測值外,1～3號土壤在GA、GA-Ca培養(yǎng)基上鏈霉菌數(shù)量的EM I也符合濕土小于干土的趨勢;在HA培養(yǎng)基上,1、2、3號土壤鏈霉菌數(shù)量的EM I分別減少65.2%、158.9%、47.0%,即冰箱4℃保藏的含水量較高的新鮮土樣的EM I應(yīng)低于風(fēng)干土壤,其原因尚不清楚。

圖1 供試土壤不同培養(yǎng)基上微波處理后放線菌數(shù)的微波效應(yīng)Fig.1 The EM Iof the quantity of the actinomycetes on the differentmedia in the tested soil aftermicrowave irradiation

3 討 論

為了分離到更多的新放線菌種類,很多學(xué)者不斷對放線菌分離方法進(jìn)行探索,研究工作主要集中在樣品預(yù)處理、抑制劑選擇以及改變培養(yǎng)基成分等方面。樣品預(yù)處理包括物理方法處理與化學(xué)方法處理。化學(xué)方法主要是通過添加適當(dāng)濃度的某種化學(xué)抑制劑,抑制鏈霉菌的生長,或者加入孢子激活劑,促進(jìn)孢子萌發(fā),從而選擇性地分離出稀有放線菌。如姜怡等[9]向土壤懸液加入6%的酵母膏和0.05%的十二烷基磺酸鈉混合液,在40℃處理20 min,能有效地分離到小單孢菌屬、鏈孢囊菌屬、馬杜拉菌屬及小雙孢菌屬等稀有放線菌。物理方法主要有干熱預(yù)處理[21]、超聲波振蕩、土壤懸液差速離心法以及極高頻輻射法等[9]。Li等[10]使用1 kHz以上的極高頻射線(EHF)對土壤懸液進(jìn)行照射,發(fā)現(xiàn)在波長8～11.5 mm時(shí),各稀有放線菌總數(shù)較對照提高了7.5倍。Li等[11]使用連續(xù)照射與極高頻輻射結(jié)合的方法,發(fā)現(xiàn)在波長為4.6～5.8 mm及8～11.5 mm時(shí),放線菌總數(shù)與稀有放線菌的種類及數(shù)量大幅度提高。Likhacheva等[12]用超高頻輻射法(SHF)對幾種鏈霉菌孢子懸液進(jìn)行不同時(shí)間的預(yù)處理,發(fā)現(xiàn)不同處理時(shí)間鏈霉菌的生物量以及活性均受到不同程度的影響。微波是一種高頻電磁波,利用微波殺菌已有大量研究及應(yīng)用。但用微波處理改善放線菌分離效果研究很少,國外僅有Bulina等[2]將其應(yīng)用于放線菌分離的初步研究報(bào)道,該研究發(fā)現(xiàn),小功率、短時(shí)間微波處理對放線菌分離效果有一定影響,使用80 W微波對土壤懸液處理30 s時(shí)能有效提高小單孢菌屬、小多孢菌屬、諾卡氏菌屬及馬杜拉菌屬等稀有放線菌的比率。楊斌等[17]研究了微波處理時(shí)間對不同有機(jī)質(zhì)含量沙質(zhì)土壤放線菌分離效果的影響,發(fā)現(xiàn)微波處理后高有機(jī)質(zhì)土壤放線菌總數(shù)、鏈霉菌數(shù)以及小單孢菌數(shù)較對照有一定程度的增加,120 W中等強(qiáng)度、3 min條件下處理效果最好。本試驗(yàn)研究了該條件下微波處理鈣質(zhì)土壤對放線菌分離效果的影響,發(fā)現(xiàn)微波處理后絕大部分供試鈣質(zhì)土壤在GA、GA-Ca及HA 3種培養(yǎng)基上的放線菌總數(shù)、鏈霉菌數(shù)、小單孢菌及未鑒定放線菌數(shù)量均有明顯增加,與楊斌等微波處理不同有機(jī)質(zhì)含量沙質(zhì)土壤時(shí)得到的結(jié)果[17]一致,表明微波處理土壤對放線菌分離時(shí)出菌量的提高效果具有較為廣泛的一致性。

另外,本研究探討了微波處理對鈣質(zhì)土壤放線菌在不同培養(yǎng)基上分離效果的影響,發(fā)現(xiàn)加鈣培養(yǎng)基(GA-Ca)上的微波效應(yīng)(EM I)小于高氏1號培養(yǎng)基(GA),該結(jié)果說明加鈣也能提高放線菌的出菌率。鑒于在現(xiàn)有分離方法和條件下,土壤中可培養(yǎng)放線菌的數(shù)量是一定的,如果加鈣激活一部分孢子,剩余的待微波激活的孢子量就會減少,導(dǎo)致在加鈣培養(yǎng)基GA-Ca上的EM I小于高氏1號,該推論尚待進(jìn)一步證實(shí)。

在本研究中,將待處理土壤樣品置于裝水量500 mL、24℃的水浴中,消除了微波處理期間加熱引起樣品溫度升高產(chǎn)生的熱效應(yīng),故本研究中微波處理對放線菌出菌率的影響主要來自微波高頻電磁波的生物效應(yīng)。初步推斷,微波對放線菌出菌率的增加可能與放線菌孢子的通透性改變有關(guān)。短時(shí)間微波處理濕土可能改變細(xì)胞膜的通透性,影響水分和養(yǎng)分進(jìn)入孢子,促進(jìn)部分難萌發(fā)孢子萌發(fā),增加出菌量,本研究中風(fēng)干土樣的微波處理效應(yīng)大于濕土樣的結(jié)果也支持微波處理影響孢子膜透性的推斷。但上述推論及微波增加放線菌出菌量的詳細(xì)機(jī)理尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。

[1] 劉志恒.放線菌—微生物藥物的重要資源[J].微生物學(xué)通報(bào),2005,32(6)：143-145.

[2] Bulina T I,Alferova IV,Terekhova L P.A novel approach to isolation of actinomycetes involving irradiation of soil samples with microwaves[J].Microbiology,1997,66(2)：231-234.

[3] Hayakawa M,Sadakata T,Kajiura T,et al.New methods for the highly selective isolation of micromonospora and microbispora from soil[J].Journal of Fer mentation and Bioengineering,1991,72(5)：320-326.

[4] Hayakawa M,Kajiura T,Nonomura H.New methods for the highly selective isolation of streptosporangium and dactylosporangium from soil[J].Journal of Fermentation and Bioengineering,1991,72(5)：327-333.

[5] Hayakawa M,Tamura T,Nonomura H.Selective isolation of actinoplanes and dactylosporangium from soil by usingγ-collidine as the chemoattractant[J].Journal of Fermentation and Bioengineering,1991,72(6)：426-432.

[6] HayakawaM,Tamura T,Iino H,et al.Pollen-baiting and drying method for the highly selective isolation of actinoplanes spp.from soil[J].Journal of Fermentation and Bioengineering,1991,72(6)：433-438.

[7] HayakawaM,Momose Y,Kajiura T,et al.A selective isolation method for Actinomadura viridis in soil[J].Journalof Fermentation and Bioengineering,1995,79(3)：287-289.

[8] Hendricks CW,Pascoe N.Soilmicrobial biomass estimates using 2450MHz microwave irradiation[J].Plant and Soil,1988,110(1)：39-47.

[9] 姜怡,段淑蓉,唐蜀昆,等.稀有放線菌分離方法[J].微生物學(xué)通報(bào),2006,33(1)：181-183.

[10] Li YV,Terekhova L P,GapochkaM G.Isolation of actinomycetes from soil using extremely high frequency radiation[J].Microbiology,2002,71(1)：105-108.

[11] Li YV,Terekhova L P,Alferova IV,et al.The application of succession analysis in combination with EHF irradiation to the selective isolation of actinomycetes from soil[J].Microbiology,2003,72(1)：114-117.

[12] Likhacheva A A,Komarova A S,Luk yanov A A,et al.The Influence of SHF radiation on soil streptomycetes[J].Eurasian Soil Science,2006,39(8)：854-858.

[13] 肖煒,李銘剛,崔曉龍,等.幾種選擇性分離稀有放線菌的方法[J].微生物學(xué)通報(bào),2006,33(1)：133-137.

[14] 楊宇容,徐麗華,段若玲,等.稀有放線菌分離方法的研究[J].云南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1997,19(4)：403-408.

[15] 張學(xué)武,張建麗.稀有放線菌的選擇性分離[J].生命科學(xué)儀器,2005,3(6)：17-20.

[16] 吳道澄,金友煌,席曉莉,等.高功率微波對金黃葡萄球菌殺滅效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國醫(yī)學(xué)物理學(xué)雜志,1999,16(3)：183-186.

[17] 楊斌,薛泉宏,陳占全,等.微波處理對土壤放線菌分離效果的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2008,19(5)：1091-1098.

[18] 鮑士旦.土壤農(nóng)化分析[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,2000.

[19] 程麗娟,薛泉宏.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].西安：世界圖書出版公司,2000.

[20] 林超峰,陳占全,薛泉宏,等.青海三江源地區(qū)風(fēng)沙土養(yǎng)分及微生物區(qū)系[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2007,18(1)：101-106.

[21] 司美茹,薛泉宏,來航線.放線菌分離培養(yǎng)基篩選及雜菌抑制方法研究[J].微生物學(xué)通報(bào),2004,31(2)：61-65.