王海濤　王洪光

摘 要:目的:研究PTEN、P16、Rhoc基因表達與骨肉瘤的關(guān)系。方法:選取20例骨肉瘤患者和20例骨軟骨瘤患者,用免疫組化SP法檢測PTEN蛋白的表達;RT-PCR法檢測P16、Rhoc mRNA的表達。結(jié)果:PTEN蛋白和P16 mRNA在骨軟骨瘤中的表達分別為123.00±9.26和0.80±0.02,顯著高于骨肉瘤中的57.75±8.30和0.36±0.11(P<0.05);Rhoc mRNA在骨肉瘤中的表達為0.93±0.04,高于骨軟骨瘤中的0.54±0.05(P<0.05)。結(jié)論:PTEN、P16、Rhoc與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān),且三者具有相關(guān)性。臨床上聯(lián)合檢測PTEN、P16、Rhoc的表達對骨肉瘤的早期診斷、預(yù)后判斷具有指導意義。

關(guān)鍵詞:骨肉瘤;PTEN;P16;Rhoc

中圖分類號:R730.231+3文獻標識碼:A文章編號:1673-2197(2009)06-0018-02

骨肉瘤是最常見的骨原發(fā)性惡性腫瘤,好發(fā)于青少年,惡性程度高,預(yù)后差,是嚴重影響青壯年健康的惡性腫瘤。傳統(tǒng)治療方法如手術(shù)切除、截肢加輔助化療,創(chuàng)傷大,存活率低。其病因和發(fā)病機制迄今尚不清楚,因此,在基因水平上了解骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展,對于更好地選擇治療方法具有重要意義。我們運用免疫組化法和RT-PCR法,檢測骨肉瘤中PTEN、P16、Rhoc的表達水平,探討其在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制,以期為骨肉瘤的臨床診斷和治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

骨肉瘤標本分別來自20例骨肉瘤手術(shù)治療患者,其中男13例,女7例;年齡10-50歲,平均27.1歲。根據(jù)WHO骨肉瘤分類標準,一般型10例,成軟骨型2例,成纖維型1例,血管擴張型3例,髓內(nèi)高分化型1例,惡性纖維組織細胞瘤型1例,骨旁骨肉瘤1例,小細胞型1例;組織學分級:高分化(Ⅰ～Ⅱ級)14例,低分化(Ⅲ級)6例。以同期收檢的20例骨軟骨瘤手術(shù)切除標本作為對照。標本于手術(shù)切下后分別置于液氮中保存;甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,3μm連續(xù)切片。

1.2 檢測試劑及方法

采用免疫組化SP法。鼠抗人PTEN單克隆抗體及SP試劑盒均購自北京博奧森生物技術(shù)公司。實驗步驟嚴格按試劑盒說明書進行。用已知陽性切片作為陽性對照,用PBS代替一抗作為陰性對照。每例均隨機觀察8個高倍視野,讀取陽性細胞數(shù)。

Trizol試劑購自美國invitrogen公司;RT-PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。根據(jù)登錄GenBank中檢索人P16、RhoC基因已知序列,應(yīng)用Priemer5.0軟件設(shè)計引物堿基對序列,由寶生物工程(大連)有限公司合成?？俁NA提取及逆轉(zhuǎn)錄和PCR各操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學處理

用SPSS11.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,指標測定結(jié)果計量資料以x±s表示,采用t檢驗。P<0.05為組間差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PTEN在骨肉瘤及骨軟骨瘤中的表達

PTEN陽性染色主要定位于腫瘤細胞胞漿,亦為棕黃色顆粒。結(jié)果見表1。

2.2 P16、RhoC mRNA的表達結(jié)果

骨肉瘤組P16產(chǎn)物電泳條帶暗、產(chǎn)量低,RhoC產(chǎn)物條帶強、產(chǎn)量高。結(jié)果見表2。

3 討論

P16是一種新型抑癌基因,位于人類染色體9P16區(qū),與細胞周期調(diào)節(jié)密切相關(guān),該蛋白是CDK4的抑制因子,通過與細胞周期蛋白D1以競爭方式結(jié)合CDK4,抑制CDK4的活性,使細胞停滯于G0期和G1期,抑制細胞分裂增殖。CDK4可能通過調(diào)節(jié)多種底物的磷酸化,是G1-S期和G2-M期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵。體外研究證實,P16蛋白能特異地抑制CDK4的活性。細胞周期蛋白D表現(xiàn)某種癌基因的作用,當其過度表達時,細胞便會向癌變發(fā)展。細胞周期蛋白D同CDK4結(jié)合時,可刺激細胞生長分裂;P16與CDK4結(jié)合時,致使其磷酸化活性降低,引起Rb磷酸化而導致腫瘤細胞死亡[1,2]。可見P16既是細胞周期固有的調(diào)控者,又是抑制腫瘤生長的關(guān)鍵成分。

PTEN基因位于人類10q23,是近年來發(fā)現(xiàn)的具有雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因,其活性的改變與多種腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系。PTEN基因編碼的蛋白具有磷酸酯酶的特征和作用,可負向調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路,對抗PI3K途徑轉(zhuǎn)導的生長和生存信號,抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。劉偉等[3]對43例非小細胞肺癌組織和20例癌旁正常肺組織PTEN表達情況的研究顯示,PTEN在肺癌組織中的表達率為46.5%,而在癌旁組織中的表達率為95.0%,兩組間比較有顯著性差異。Levine等[4]報道,在犬的骨肉瘤細胞系和骨肉瘤組織中都可看見PTEN蛋白表達下降。

影響腫瘤細胞侵襲性的因素有很多,其中腫瘤細胞的運動能力是關(guān)鍵因素之一。許多實驗均提示:腫瘤細胞的運動能力與侵襲性之間有密切關(guān)系[5],高侵襲轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞往往具有較強的運動能力。腫瘤細胞運動的關(guān)鍵蛋白是激動蛋白,而RhoC又是調(diào)控激動蛋白的關(guān)鍵基因。

本研究發(fā)現(xiàn),骨軟骨瘤中PTEN蛋白和P16 mRNA的表達顯著高于骨肉瘤;而骨肉瘤中的Rhoc mRNA表達則明顯高于骨軟骨瘤。這說明p16和PTEN表達減低有可能使癌細胞獲得某種生長優(yōu)勢,預(yù)示這些患者預(yù)后不良;而Rhoc表達增強說明骨肉瘤細胞侵襲運動能力增加。

綜上所述,PTEN、P16、Rhoc與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān),且三者具有協(xié)同性。深入研究PTEN、P16、Rhoc的協(xié)同作用,將對骨肉瘤的預(yù)防、臨床治療及預(yù)后的判斷具有重要意義。

參考文獻:

[1] 高嵩,趙炬才,張廣泉.人骨肉瘤組織PTEN蛋白的表達及臨床意義[J].實用診斷與治療雜志,2005,19(2):933.

[2] LUKAS J,PARRY D,AAGAARD L,et al. Retinoblastoma-protem-dependent cell-cycle inhibition by the tumour suppressor p16[J]. Nature,1995,375(6531):503-506.

[3] 劉偉,于文成,時衍同,等.PTEN在非小細胞肺癌中的表達及其意義[J].齊魯醫(yī)學雜志,2005,20(3):217-221.

[4] LEVINE RA,FOREST T,SMITH C.Tumor suppressor PTEN is mutated in canine osteosarcoma cell lines and tumors[J]. Vet Pathol,2002(39):372-378.

[5] LIU B,KOTENBERG SA,MIRKIN MV.Scanning electrochemical microscopy of living cells:different redox activities of nonmetastatic and metastatic human breast cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(18):9855-9860.

(責任編輯:曾楚華)